一种猪流行性腹泻病毒及其应用制造技术

一种猪流行性腹泻病毒毒株PEDV‑KB2013‑4株，其微生物保藏编号为CGMCC No.12663；分类命名：猪流行性腹泻病毒 Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

A porcine epidemic diarrhea virus and its application

Porcine epidemic diarrhea virus strain PEDV KB2013 4 strains, the microbial preservation number is CGMCC No.12663; classification and nomenclature: porcine epidemic diarrhea virus Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV; the preservation time is 2016 08 month 23 days; the preservation unit for General Microbiology center Chinese microbe preservation Management Committee; address: Beijing Chaoyang District city preservation No. 1 Beichen West Road, No. 3 hospital, China Institute of Microbiology Chinese Academy of sciences.

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒及其应用
本专利技术属于生物
，具体属于兽用生物制药领域，涉及一种猪流行性腹泻病毒及其应用。
技术介绍
猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）引起一种急性、接触性病毒性肠道传染病，其病症以呕吐、水样腹泻、食欲下降和脱水为主，是常见的猪肠道传染性疾病。猪流行性腹泻病毒（PEDV）系冠状病毒科冠状病毒属成员，猪流行性腹泻病毒（PEDV）经口鼻感染后直接进入小肠，在小肠上皮细胞增殖，引起小肠绒毛吸收上皮细胞病变、损伤、脱落和小肠绒毛萎缩，导致肠内酶活性降低，吸收功能障碍，肠道内渗透压增高，引发渗透性腹泻，最终造成掉膘、降低饲料吸收利用率。PEDV严重影响了我国的养猪业，其感染性强、危害性大，是影响全球养猪业的最重要病毒之一，哺乳仔猪感染后死亡率可达100％，母猪常以带毒而不表现症状形式出现。近几年我国多省爆发PED，给养猪业造成了严重的经济损失。目前尚无治疗猪流行性腹泻的特效药物，常规治疗效果不佳，因此仍以疫苗预防为主，而病毒株及其培养的成功与否是疫苗研制的关键因素。目前，国外使用的疫苗主要为韩国弱毒株，国内主要是哈尔滨兽医研究所研制的猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎二联灭活苗等，此疫苗中使用的毒株为猪流行性腹泻病毒PEDVCV777株，该毒株分离年代较早，通过对现流行毒株的基因分析，发现流行毒株与二十世纪70年代分离到的CV777毒力基因发生了较大的改变，所以这也许是用含有原始毒株的疫苗免疫失败的原因之一。因此筛选新毒株，制备行猪流行腹泻疫苗用于预防猪流行性腹泻是十分必要的。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术旨在提供一种猪流行性腹泻病毒及其应用，该毒株遗传稳定，免疫原性能好，用其制备的疫苗对于猪流行性腹泻具有良好的保护效力。为解决以上技术问题，达成本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了一种猪流行性腹泻病毒毒株(PEDV-KB2013-4株)，其微生物保藏编号为CGMCCNo.12663；分类命名：猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV)；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术还请求保护猪流行性腹泻病毒毒株PEDV-KB2013-4株在制备治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。具体地，本专利技术请求保护猪流行性腹泻病毒毒株PEDV-KB2013-4株在制备预防猪流行性腹泻病毒感染的疫苗中的应用。优选地，所述疫苗为灭活疫苗。与现有的商品化疫苗毒株相比，本专利技术所筛选的猪流行性腹泻病毒PEDV-KB2013-4株具有免疫原性好，抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，免疫剂量小，在产前42天前进行灭活疫苗的免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。附图说明：图1：PEDV-KB2013-4株接种Vero细胞在不同时期的CPE图片，其中图1-A、图1-C、图1-F分别为未接种病毒的Vero细胞培养24h、36h、48h后的细胞图像；图1-B、图1-D、图1-F分别为接种PEDV-KB2013-4株24h、36h、48h后的CPE图像。图2：PEDVRT-PCR检测结果，通道1：TakaraDNAMaker；通道2：阳性对照；通道3：第9代病毒液；通道4：阴性对照。图3：母猪免疫不同疫苗后的抗体水平检测结果。具体实施方式：实施例1：猪流行性腹泻病毒PEDV-KB2013-4株的分离鉴定（1）猪流行性腹泻病毒PEDV-KB2013-4株的分离在流行病学调查时，陕西某猪场送检腹泻仔猪小肠，刮取肠粘膜和内容物，按照1:5的比例（重量：体积）加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液中加入终浓度为20μg/ml的胰酶，37℃处理1.5小时。按常规方法接种长满单层的Vero细胞（接种前用pH7.4的PBS洗三次），按照10%的比例接种病毒，37℃吸附1小时，补足细胞维持液（含10µg/ml的胰酶），37℃温箱培养。如此操作盲传至第10代，观察是否产生CPE，同时设置空白细胞作为对照。盲传传至第5代时细胞出现轻微的CPE变化，传至第9代时则出现明显、稳定的CPE变化，细胞圆缩，颗粒增加，聚堆呈葡萄串样，细胞出现损伤和脱落，即分离得到PEDV-KB2013-4株。说明书附图图1展示了PEDV-KB2013-4株接种Vero细胞在不同时期的CPE图片，其中图1-A、图1-C、图1-F为对照组，其图像分别为未接种病毒的Vero细胞培养24h、36h、48h后的细胞图像，由图可知，直到Vero细胞培养到48h，细胞仍保持致密单层，仅有少量细胞脱落；图1-B、图1-D、图1-F分别为接种PEDV-KB2013-4株24h、36h、48h后的CPE图像，图1-B是接种PEDV-KB2013-4株24h产生的病变，其中有少量的细胞开始圆缩、脱落，图1-D是接种PEDV-KB2013-4株36h后产生的病变，有较多的细胞开始脱落，细胞间的空隙变大；图1-F是接种PEDV-KB2013-4株48h后产生的病变，细胞开始大量脱落，达到75%以上，且细胞间聚堆呈葡萄串样，表现为典型的网状CPE症状。（2）病毒PT-PCR检测按照OMEGA试剂盒的说明进行RNA的提取，产品立即进行反转录或贮存于-80℃备用。并合成检测引物PEDVF：5’-aacggttctattcccgttgatg-3’；PEDVR：5’-taaatgaagcactttctcactatc-3’。取总RNA5.25µL，5×Buffer2µL，dNTP(10mMeach)0.5µL，下游引物（PEDV-R）1µL，AMV反转录酶0.5µL，RNA酶抑制剂0.25µL，总体积10µL。反应条件：37℃10min，42℃反转录1h，冰浴2min。取RT产物1µL，2×PromegaMix12.5ul，引物PEDV-F、PEDV-R各1ul，高压灭菌水9.5ul，总体积25ul。反应条件：94℃3min，94℃30s，60℃45s，72℃45s，35个循环，72℃7min。扩增后的产物，进行琼脂糖凝胶电泳，扩增出目的条带645bp，参见说明书附图图2，经测序鉴定，所述病毒分离毒株为PEDV。（3）病毒滴毒测定取第10代病毒，用细胞维持液进行10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度，每个稀释度分别接种长满Vero细胞单层的96孔细胞板6孔，100μl/孔，同时设阴性对照细胞6孔，37℃5%CO2培养箱培养72～120小时，观察细胞病变，细胞颗粒增多，圆缩，细胞破损，脱落判为感染。同时阴性对照组细胞孔应不出现细胞病变。采用Reed-Muench法，计算TCID50。经测定，病毒含量为5×105TCID50/ml。（4）动物回归试验取PEDV中和抗体均小于1：8的母猪所产的3～5日龄仔猪10头，每头口服2ml第10代病毒，观察7天，统计接种猪的发病情况，对试验猪进行剖检，观察本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪流行性腹泻病毒毒株PEDV‑KB2013‑4株，其微生物保藏编号为CGMCC No.12663；分类命名：猪流行性腹泻病毒 Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒毒株PEDV-KB2013-4株，其微生物保藏编号为CGMCCNo.12663；分类命名：猪流行性腹泻病毒PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。2.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒毒株PEDV-KB2013-4株在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。3.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒毒株PEDV-KB2013-4株在制备预防猪流行性腹泻的疫苗中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗，其由佐剂和灭活的PEDV-KB2013-4株疫苗原液制备而成。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的佐剂由以质量百分含量计的5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温60、93%0.005M柠檬酸钠组成。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗经由以下方法制备得到：a.按照常规方法制备Vero细胞，生长液为含10%新生牛血清的DMEM，培养至细...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，薛青红，陈瑞，孙丰廷，戚伟强，
申请(专利权)人：陕西诺威利华生物科技有限公司，中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：陕西,61