本发明专利技术涉及基因疫苗技术领域，特别涉及一种Ii基因序列在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中的应用，Ii基因碱基序列见序列表中序列8。将Ii基因载体和S1（m）基因载体混合或者将Ii基因与S1（m）基因连接后用于猪流行性腹泻病毒基因疫苗的制备，S1（m）基因碱基序列见序列表中序列10。在经密码子优化的S1基因的基础上，成功构建了真核表达质粒pVAX‑S1（m）和pVAX‑Ii‑S1（m），小鼠免疫试验验证S1蛋白的免疫原性和Ii作为分子佐剂在提高体液和细胞免疫中发挥的作用，首免后63d出现特异性抗体，首免后84d抗体明显升高，为研制PEDV疫苗提出新的思路，为猪体试验奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因疫苗
，特别涉及一种Ii基因序列在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中的应用。
技术介绍
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种急性肠道传染性疾病，临床症状以腹泻、呕吐、脱水为主要特征。PEDV属于冠状病毒，是有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV编码4个结构蛋白S蛋白(spikeprotein)、E蛋白(smallmemberprotein)、M蛋白(memberprotein)和N蛋白(nucleoprotein)。S蛋白在受体结合、诱导中和抗体和促进病毒和细胞融合等方面发挥着重要作用。自2010年，PED在我国南方省份暴发，在短短一年内导致上百万头猪死亡并蔓延至全国，对我国的养猪业造成了严重损失。另外，韩国、日本、越南、泰国甚至美国均出现PED暴发，导致仔猪大范围死亡。PED暴发对仔猪损害最为严重，尤其是出生7d内的仔猪，呈现传播范围广、感染率和死亡率高等特点。但成年猪感染PEDV仅表现轻微的临床症状。由于病程较短，仔猪体内来不及产生主动免疫应答，目前主要采取的免疫方法是免疫母猪，产生含有抗体的初乳，仔猪通过吸允初乳获得被动性免疫。目前商品化疫苗主要是弱毒疫苗，包括我国的CV777、韩国的KPEDV-9和DR13、日本的P-5V，但这些疫苗的免疫效果均不理想。近年来，国内外学者研究探索了各种形式的疫苗，包括转基因植物疫苗、重组腺病毒疫苗和亚单位疫苗等，但是均不能诱导有效的免疫应答和免疫保护。研究人员证实PEDV流行毒株发生变异，尤其是免疫原性较好的S蛋白变异最大，这也许是以往疫苗不能有效防控目前PED的原因。DNA疫苗也称核酸疫苗，是通过重组DNA技术将具有保护性抗原基因克隆至真核表达载体，经一定的途径导入宿主体内，通过宿主细胞表达外源蛋白并诱导产生免疫反应。目前通过美国FDA批准进入临床试验的DNA疫苗包括艾滋病、肿瘤、埃博拉病毒和疟疾等DNA疫苗。DNA疫苗在接种宿主后，通过宿主细胞的转录翻译系统能够正确表达外源蛋白质的天然构象，在靶器官和细胞持续表达抗原，可诱导全面的免疫应答反应。另外，DNA疫苗制备简便、成本较低、储存方便，没有毒力返强或者残留的危险，能够避免免疫逃避现象。但是，DNA疫苗存在生物安全性问题，如外源DNA与宿主基因组整合和免疫耐受的可能性；另外，质粒导入宿主的效率低和外源基因在宿主细胞表达水平低导致了DNA疫苗免疫效果下降。如何提高DNA疫苗诱导的抗体水平是当前研究DNA疫苗的重点。MHCII类分子恒定链(Invariantchain,Ii)是MHCII类分子生物合成中的重要分子伴侣，属于II型跨膜蛋白，呈非多肽性。Ii作为MHCII类分子的伴侣蛋白，在MHCII类分子复合物的形成、分选及内化中起着重要作用，同时Ii能够阻断MHCII类分子的抗原结合位点，防止其与内源性抗原结合，起着保护未成熟MHCII类分子作用。尤为重要的是Ii能够促进B细胞成熟、T细胞分化及增强抗原递呈，已被用于一种免疫载体。至今没有MHCII类分子恒定链融合蛋白在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中应用的相关记载。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中DNA疫苗免疫效果低、至今没有MHCII类分子恒定链融合蛋白在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中应用的相关记载的问题，本申请提供了一种Ii基因序列在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中的应用。本专利技术是通过以下步骤得到的：Ii基因序列在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中的应用，所述Ii基因碱基序列见序列表中序列8。所述的应用，优选将Ii基因载体和猪流行性腹泻病毒S1(m)基因载体混合或者将Ii基因与猪流行性腹泻病毒S1(m)基因连接后用于猪流行性腹泻病毒基因疫苗的制备，S1(m)基因碱基序列见序列表中序列10。所述的应用，优选Ii基因与S1(m)基因通过2A基因连接，Ii-2A基因碱基序列见序列表中序列9。所述的应用，优选Ii基因增强猪流行性腹泻病毒S1(m)基因蛋白诱导产生的体液免疫和细胞免疫应答，提高ELISA抗体水平，促进分泌IL-4的T细胞产生。所述的应用，优选操作如下：(1)设计并合成用于扩增Ii基因的引物，见序列表中序列6和7，设计并合成用于扩增猪流行性腹泻病毒S1(m)基因的引物，见序列表中序列4和5；(2)提取猪脾脏RNA，以反转录得到的cDNA为模板，用序列表中序列6和7经PCR扩增得到Ii基因，碱基序列见序列表中序列8；以优化合成的S1(m)基因为模板，用序列表中序列4和5经PCR扩增得到S1(m)基因，碱基序列见序列表中序列10；(3)将Ii基因和S1(m)基因分别插入质粒pVAX得到重组质粒pVAX-Ii和pVAX-S1(m)，将两种重组质粒混合后使用。所述的应用，优选操作如下：(1)设计并合成用于扩增Ii基因的引物，见序列表中序列6和7，设计并合成用于扩增口蹄疫2A基因的Ii基因Ii-2A的引物，见序列表中序列1、2和3，设计并合成用于扩增猪流行性腹泻病毒S1(m)基因的引物，见序列表中序列4和5；(2)提取猪脾脏RNA，以反转录得到的cDNA为模板，用序列表中序列6和7经PCR扩增得到Ii基因，碱基序列见序列表中序列8；以得到的Ii基因为模板，分别用序列表中序列1和2、序列表中序列1和3经PCR逐步扩增得到Ii-2A基因，碱基序列见序列表中序列9；以优化合成的S1(m)基因为模板，用序列表中序列4和5经PCR扩增得到S1(m)基因，碱基序列见序列表中序列10；(3)将Ii-2A基因与S1(m)基因连接，并连接入质粒pVAX得到重组质粒VAX-Ii-2A-S1(m)。所述的应用，优选PCR体系为2×primerSTARMix12.5μl，F引物1.0μl，R引物1.0μl，模板0.2μl，ddH2O11.3μl，总计25.0μl。所述的应用，优选PCR反应程序是98℃1s；98℃10s，55℃30s，72℃2min30s进行35个循环，72℃5min。为了提高DNA疫苗的免疫效果，本实验尝试了多种方法，如根据哺乳动物密码子偏嗜性进行了S1基因修饰；加入分子佐剂Ii提高S1蛋白诱导的免疫应答；免疫前在小鼠腿部肌肉注射盐酸利多卡因提高细胞摄入真核质粒的效率。其中加入分子佐剂Ii提高S1蛋白诱导的免疫应答效果较理想。本专利技术的有益效果：1)本试验在经密码子优化的S1基因的基础上，成功构建了真核表达质粒pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-2A-S1(m)，小鼠免疫试验验证S1蛋白的免疫原性和Ii作为分子佐剂在提高体液和细胞免疫中发挥的作用，首免后63d出现特异性抗体，首免后84d抗体明显升高，2)本实验构建融合表达密码子优化的S1蛋白和Ii蛋白的重组真核表达质粒，经小鼠免疫试验验证DNA疫苗的免疫特性，为研制PEDV疫苗提出新的思路，为猪体试验奠定了基础。附图说明图1为目的基因的PCR扩增，A:M:1KbDNAMarker；1:Negativecontrol；2:S1(m)；B:M:DL2000DNAMarker；1:Negativecontrol；2:Ii；C:M:DL2000DNAMarker；1:Negativeco本文档来自技高网...
【技术保护点】
Ii基因序列在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中的应用，所述Ii基因碱基序列见序列表中序列8。
【技术特征摘要】
1.Ii基因序列在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中的应用，所述Ii基因碱基序列见序列表中序列8。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将Ii基因载体和猪流行性腹泻病毒S1（m）基因载体混合或者将Ii基因与猪流行性腹泻病毒S1（m）基因连接后用于猪流行性腹泻病毒基因疫苗的制备，S1（m）基因碱基序列见序列表中序列10。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于Ii基因与S1（m）基因通过2A基因连接，Ii-2A基因碱基序列见序列表中序列9。4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于Ii基因增强猪流行性腹泻病毒S1（m）基因蛋白诱导产生的体液免疫和细胞免疫应答，提高ELISA抗体水平，促进分泌IL-4的T细胞产生。5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于操作如下：（1）设计并合成用于扩增Ii基因的引物，见序列表中序列6和7，设计并合成用于扩增猪流行性腹泻病毒S1（m）基因的引物，见序列表中序列4和5；（2）提取猪脾脏RNA，以反转录得到的cDNA为模板，用序列表中序列6和7经PCR扩增得到Ii基因，碱基序列见序列表中序列8；以优化合成的S1（m）基因为模板，用序列表中序列4和5经PCR扩增得到S1（m）基因，碱基序列见序列表中序列10；（3）将Ii基因和S1（m）基因分别插入质粒pVAX得到重组质粒pVAX-Ii和pVAX-S1（m）...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜平，赵攀登，白娟，王先炜，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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