本发明专利技术公开了猪传染性胃肠炎S/N蛋白融合基因及重组乳酸乳球菌和应用。本发明专利技术提供了由猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中A、D抗原位点和N蛋白中的N321抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列连接一起后得到的融合基因，其核苷酸序列为SEQ?ID?No.1所示。本发明专利技术进一步提供了含有该融合基因的表达载体及含有该重组表达载体的重组乳酸乳球菌菌株。将重组乳酸乳球菌菌株用乳链杆菌肽Nisin进行诱导，融合基因可在细菌细胞壁表面进行表达。免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性，可将其制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗原融合基因以及含有该抗原融合基因的重组菌株，尤其涉及猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白融合基因以及含有该融合基因的表达载体，本专利技术进一步涉及含有该表达载体的重组乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)菌株以及它们在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途，属于猪传染性胃肠炎的防治领域。
技术介绍
猪传染性胃肠炎是由传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritisvirusof swine, TGEV)所引起的以严重腹泻、呕吐、脱水和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病。TGEV主要存在于空肠和十二指肠，各种日龄的猪均易感。由于仔猪自身抵抗力比较差，易受外界各种刺激因素的影响和病原微生物的侵袭，常会因严重脱水而发生死亡，并以2周龄以内的仔猪死亡率 最高，可达100%。随日龄的增大，虽然死亡率逐渐下降，但感染该病的猪生产性能下降，饲料报酬率低，给世界范围内的养猪业都带来严重的经济损失。猪传染性胃肠炎病毒主要通过肠道感染猪，具有明显的肠道组织嗜性的特点，在抗TGEV感染免疫过程中除体液免疫和细胞免疫外，局部肠粘膜免疫系统发挥着不可替代的作用。常规的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治这两种疾病中起到了积极作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些问题，如灭活疫苗免疫原性差，不能有效诱导slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接种后的动物机体排散病毒、病毒毒力可能返强等，另外必须通过注射途径免疫。针对本病的特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径，但是如何避免胃肠道对抗原的破坏并有效诱导免疫应答成为技术的关键。TGEV有三种主要结构蛋白，分别为磷酸化的核衣壳蛋白N、膜蛋白M和糖基化的纤突蛋白S，其中S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定族，并且可以介导细胞的吸附、中和抗体的产生等过程，可以提供有效的免疫保护作用。TGEV感染具有明显的嗜肠性，病毒粒子表面的纤突蛋白(S蛋白)与存在于肠上皮细胞顶膜的氨基肽酶(APN)的结合是感染发生的首要条件，粘膜免疫是本病特异性免疫应答的主要特征，肠道粘膜表面SIgA含量的高低直接决定临床疾病的发生和疾病严重程度。针对猪传染性胃肠炎发病的几个特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径。口服免疫突出的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，但口服免疫需要克服免疫原在到达小肠粘膜之前被降解或灭活的可能。使用细菌病毒等活载体来传递完整无损的抗原成分解决了这个问题，目前有使用减毒细菌作为疫苗抗原的载体的报道，如沙门氏菌、弱毒李斯特菌等，但沙门氏菌作为载体传递DNA疫苗可能存在毒力返强的危险，质粒DNA也可能会整合到宿主细胞基因组，引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、体细胞癌变、细胞转型等一系列问题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原融合基因及其编码的蛋白；本专利技术的目的之二是提供含有上述猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原位点的融合基因的表达载体；本专利技术的目的之三提供含有上述表达载体的重组宿主菌株。为了实现上述目的，本专利技术一方面提供了一种由猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中A、D抗原位点和N蛋白中的N321抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列(CWAm6)连接得到的抗原融合基因，其多核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。本专利技术将TGEV S蛋白中A、D抗原位点(Sad)和N蛋白中的N321抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列(CWAm6)(以化脓链球菌M6蛋白的最后140个氨基酸为细胞壁锚定序列)连接起来，考虑到乳酸乳球菌使用密码子的偏嗜情况，为了提高异源基因在宿主菌中的表达，并保证翻译后的氨基酸不变的情况下，对稀有密码子丝氨酸(TCG)、苏氨酸(ACG)、脯氨酸(CCC)、精氨酸(CGG)、苯丙氨酸(TTC)等进行改变，但不改变其所编码的氨基酸。对A抗原位点上的3个甲基化位点(AAC — AAT，ATC — ATT，ACA — ACT)进行点突变，但不改变其所编码的氨基酸。通过两个柔性的Linker((GGGGS)3)将TGEV的A、D抗原位点基因和N32i抗原位点基因连接起来(顺序为D-Linker-N321-Linker-A),并把该序列命名为MLSN (SEQIDN0.1);此外，在MLSN的上游和下游分别引入NcoI酶切位点和SacI酶切位点。本专利技术的另一方面是提供由SEQ ID N0.1所示抗原融合基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。。本专利技术的又一方面是提供含有所述抗原融合基因的表达载体，譬如，将本专利技术的SEQ ID N0.1所示的抗原融合基因与表达载体pNZ8149进行连接，得到可以在乳酸乳球菌的外表面或细胞壁表达抗原融合基因 的分泌表达载体。由此，本专利技术的再一方面是提供一株表达猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白的重组乳酸乳球菌菌株，能够用其制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本专利技术将SEQ ID N0.1所示融合基因与分泌表达载体pNZ8149进行双酶切、连接并经电击转化转入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ3900细胞，获得含有重组质粒的乳酸乳球菌命名为NZ3900-pNZ8149-MLSN ;其微生物保藏号是:CCTCC No:M2011444 ;分类命名是:乳酸乳球菌 NZ3900-pNZ8149-MLSN (Lactococcus lactis NZ3900_pNZ8149_MLSN);保藏时间是2011年12月5日；保藏单位是:中国典型培养物保藏中心；保藏地址是:中国武汉武汉大学。进一步的，本专利技术将重组乳酸乳球菌菌NZ3900-PNZ8149-MLSN用乳链杆菌肽Nisin进行诱导，使目的基因在菌体表面进行表达；免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性，能够用于制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本专利技术构建了 NZ3900-pNZ8149-MLSN表达载体系统，表达了含有TGEV蛋白A/D位点和N蛋白N321位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列CWAM6连接序列MLSN (目的蛋白约28kDa);免疫印迹试验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性。间接免疫荧光也证实表达蛋白存在于菌体上，诱导表达后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的重组蛋白初步定位于菌体的表面，存在菌体表面的目的蛋白为抗原物质有效刺激免疫系统，提高抗体水平奠定了重要的物质基础。本专利技术针对TGEV发生和免疫的几个特点，在实验设计上以阻断肠道传染病疾病病原感染的第一道防线为目的，利用安全无毒的乳酸菌表达系统在肠道黏膜上粘附、定植和表达及传递抗原物质，因而抗原物质对黏膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途径，因此所产生的黏膜免疫保护效果将更为理想。同时，乳酸菌本身具有佐剂效应，会明显加强抗原的免疫原性，机体对乳酸菌载体系统本身不产生强的抗体应答反应，乳酸菌还可合成一些生物活性物质，如乳酸菌素、细菌素、多种有机酸等，这些物质本身就具有抑菌抗菌、抗腹泻作用。为了检验本专利技术所构建的重组乳酸乳球菌或该本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible?gastroenteritis?virus?of?swine）S/N蛋白抗原融合基因，其特征在于：其多核苷酸序列为SEQ?ID?No.1所示。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张金林，马立保，胡晓芬，
申请(专利权)人：武汉华扬动物药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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