一种乳酸片球菌来源的抗菌六肽及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种乳酸片球菌来源的抗菌六肽及其制备方法，属于生物工程领域。本发明专利技术的抗菌肽ENGEEE是首次被报道。本发明专利技术的抗菌肽乳酸菌素R16的pH稳定性和热稳定性好，对大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用，能够有效降低豆粕中大肠杆菌的数量。其次，抗菌肽乳酸菌素R16对于酿酒酵母和植物乳杆菌具有一定的增殖作用，对过氧化氢、羟自由基、DPPH·自由基和超氧阴离子具有一定的清除能力。本发明专利技术的抗菌肽乳酸菌素R16可作为生物防治使用，可作为饲料添加剂使用，在将来替代抗生素和解决饲料安全问题中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种乳酸片球菌来源的抗菌六肽及其制备方法，属于生物工程领域。
技术介绍
目前，亚治疗剂量的抗生素作为饲料添加剂被广泛应用于禽畜饲料中，其在促进动物生长、预防某些疾病发生方面发挥着重要作用，但是，随着抗生素滥用事件频繁发生，让人们对抗生素的副作用有了进一步的认识。滥用抗生素不仅会引起动物内源性感染，产生耐药菌株，而且会使畜禽免疫功能下降，更严重的是，残留于畜禽产品中的抗生素会通过不同渠道而流入人体，并对人体造成危害。欧盟监管委员会决定，自2006年1月起在动物养殖业中禁用抗生素生长促进剂。从2013年12月开始，美国FDA发布了《兽医饲料指令》，要求有执照的兽医监督抗生素的使用，计划从2014年起，用3年时间禁止在牲畜饲料中使用预防性抗生素，最大限度地减少食用牲畜带给消费者抗生素耐药性问题。韩国也将在2018年7月全面禁止饲用抗生素的使用。随着细菌对抗生素耐药性和抗生素的残留问题日益严重，研究和开发绿色饲料添加剂产品已经成为世界性的研究课题，大量研究表明，中草药提取物、微生物制剂、酶制剂、益生元、抗菌肽、酸化剂等新型饲料添加剂能有效减少或者替代饲用抗生素的使用。其中，抗菌肽由于具有较好的抗菌和免疫调节的活性，且不易残留、没有副作用、没有抗药性，对环境不产生不良影响等优点，成为了抗生素潜在的有效替代物。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术从能够抑制大肠杆菌生长的乳酸菌的发酵液中分离得到一种对细菌具有抑制作用的乳酸菌素，通过液相色谱-质谱联用技术(liquidchromatography-massspectrometry，LC-MS)初步鉴定该乳酸菌素的分子量大小为705.63Da，等电点为3.58，氨基酸序列为ENGEEE。本专利技术还通过化学合成的方法确认该乳酸菌素对多种革兰氏阳性菌具有抑制作用，将其命名为乳酸菌素R16。本专利技术的第一个目的是提供一种抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列为：ENGEEE(如SEQIDNO.1所示)，命名为乳酸菌素R16。所述抗菌肽，是从能够抑制大肠杆菌生长的乳酸菌的发酵液中分离得到的。本专利技术的第二个目的是提供编码所述抗菌肽的核苷酸片段。本专利技术的第三个目的是提供一种能够表达所述抗菌肽的重组载体或者基因工程菌。比如，可以将若干(如20)个该抗菌肽的编码基因首尾连接，在每两段基因中间添加凝血酶酶切位点，整段基因与载体连接得到重组载体，转化入宿主菌表达。表达产物经凝血酶酶切即可得到该抗菌肽。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体可以是pPIC9K。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主菌可以是毕赤酵母GS115。本专利技术的第四个目的是提供含有所述抗菌肽的组合物。在本专利技术的一种实施方式中，所述组合物为饲料添加剂、饲料、生物防腐剂。本专利技术的第五个目的是提供所述抗菌肽、编码所述抗菌肽的核苷酸片段、能够表达所述抗菌肽的重组载体或者能够表达所述抗菌肽的基因工程菌的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用，是作为饲料添加剂或者生物防腐剂。本专利技术的第六个目的是提供一种抑制细菌的方法，是使用所述的抗菌肽。在本专利技术的一种实施方式中，所述细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述细菌包括：大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等。本专利技术还提供一种所述抗菌肽的制备方法，是将乳酸片球菌发酵得到的发酵上清液先由超滤进行粗提，然后经阴离子交换色谱柱HitrapQFF和凝胶过滤色谱SuperduxPeptide10/300GL分离，最后用反相柱PhenomenexLuna/C18分离纯化得到抗菌六肽。在本专利技术的一种实施方式中，所述超滤是超滤(截留分子量3000Da)浓缩8～10倍，得到粗提液。在本专利技术的一种实施方式中，所述制备方法具体是：(1)超滤粗提：超滤(截留分子量3000Da)浓缩8～10倍，得到粗提液；(2)经阴离子交换色谱HitrapQFF的分离：粗提液上样于HitrapQFF色谱柱分离得到2个洗脱峰，收集对大肠杆菌有抑菌作用的活性峰L2，透析后冷冻干燥；(3)经凝胶过滤色谱SuperduxPeptide10/300GL的分离：将阴离子交换色谱的洗脱峰L2上样于SuperduxPeptide10/300GL凝胶过滤层析柱，分离得到2个洗脱峰，收集对大肠杆菌有抑菌作用的活性峰N2，透析后冷冻干燥；(4)反相C18柱分离：将上一步冷冻干燥的样品用5％的乙腈(含0.1％TFA，下同)溶解，并经5％的乙腈平衡的PhenomenexLuna/C18柱，用浓度为5-50％的线性梯度递增的乙腈洗脱，收集活性洗脱峰Ⅱ，并经旋转蒸发和冷冻干燥后，得到最终产品。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术的抗菌肽ENGEEE，与抗菌肽数据库(TheAntimicrobialPeptideDatabase)等数据库比对，此种抗菌肽是首次被报道。(2)本专利技术利用超滤和色谱等技术，制备对革兰氏阳性菌具有明显抗性的活性肽乳酸菌素R16。本专利技术的制备工艺简单、分离效果好、操作条件温和、快速高效、产品纯度高，经MS鉴定其纯度可达95％以上。(3)本专利技术中的获得的抗菌肽乳酸菌素R16的pH稳定性和热稳定性好，对大肠杆菌和单增李斯特菌的最小抑菌浓度为6.4mg·mL-1，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为3.4mg·mL-1。(4)本专利技术的抗菌肽乳酸菌素R16对于酿酒酵母和植物乳杆菌具有一定的增殖作用，对其他对益生菌的影响很小。(5)本专利技术的抗菌肽乳酸菌素R16对过氧化氢、羟自由基、DPPH·自由基和超氧阴离子具有一定的清除能力，清除率分别为25.65％、70.13％、79.42％和10.11％。(6)本专利技术的抗菌肽乳酸菌素R16可作为生物防治使用，是对已测氨基酸序列的乳酸菌素库的有效补充。可作为饲料添加剂使用，在将来替代抗生素和解决饲料安全问题中发挥重要作用。附图说明图1：六肽的质谱鉴定图；图2：不同pH值对乳酸菌素R16的影响；图3：温度对乳酸菌素R16的影响；图4：乳酸菌素R16对益生菌生长的影响；图5：抑菌活性物质对羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力。具体实施方式本专利技术所涉及的各种缓冲液配方均可以在实验手册中查到。实施例1：乳酸菌素R16的制备按照下面的方法制备抗菌六肽乳酸菌素R16：1.抗菌六肽经乳酸片球菌发酵而来，发酵上清液经离心之后，收集上清液超滤(截留分子量10000Da)浓缩8～10倍，得到粗提液。2.经阴离子交换色谱HitrapQFF的分离：粗提液上样于HitrapQFF色谱柱分离得到2个洗脱峰，收集对大肠杆菌有抑菌作用的活性峰，并将收集的活性峰L2经Mill-Q水充分透析后冷冻干燥。3.经凝胶过滤色谱SuperduxPeptide10/300GL的分离：将阴离子交换色谱的洗脱峰L2上样于SuperduxPeptide10/300GL凝胶过滤层析柱，分离得到2个洗脱峰，收集对大肠杆菌有抑菌作用的活性峰，并将收集的活性峰N2经Mill-Q水充分透析后冷冻干燥。4.反相C18柱的分离：将上一步冷冻干燥的样品用5％的乙腈(含0.1％TFA，下同)溶解，并经5％的乙腈平衡的C18柱，用浓度为5-50％的线性梯度递增的乙腈洗脱，收集活性洗脱峰H3，并经旋转蒸发和冷冻干燥后，最终得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为如SEQIDNO.1所示。2.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1所述的抗菌肽。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为饲料添加剂、饲料或者生物防腐剂。4.编码权利要求1所述的抗菌肽的核苷酸片段。5.一种能够表达权利要求1所述的抗菌肽的重组载体或者基因工程菌。6.权利要求1所述的抗菌肽、权利要求4所述的核苷酸片段、权利要求5所述的重组载体，或者是权利要求5所述的基因工程菌的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆健，蔡国林，王娟，朱德伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32