一种抑制淀粉样β蛋白聚集的双功能短肽抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抑制淀粉样β蛋白(Aβ)聚集的双功能短肽抑制剂及其应用。首先从Aβ的经典抑制剂LPFFD序列出发理性设计了双功能短肽抑制剂LVFFARKHH，然后通过多种实验手段证明该双功能短肽抑制剂与Aβ40摩尔浓度比在1:1时，对Aβ40聚集及其相关细胞毒性具备最佳抑制效果：能有效地抑制Aβ40纤维生成；可显著地抑制Cu2+介导的Aβ40聚集；改变Aβ40聚集路径，造成Aβ40纤维形貌的变化；可极大的降低Aβ‑Cu2+络合体催化产生氧化自由基·OH的速率；最终大幅度降低Cu2+存在下Aβ40聚集产生的细胞毒性作用。该双功能短肽抑制剂提供了用于阿尔兹海默症的原料药和保健品开发方面的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种双功能短肽抑制剂(Ac-LVFFARKHH-NH2)及其对Cu2+介导的淀粉样β蛋白的聚集、氧化自由基粒子产生率和细胞毒性的有效抑制作用，以及其潜在的药物和保健品开发方面的用途。
技术介绍
阿尔兹海默症(Alzheimer’sDisease,AD)是一种淀粉样变病，该病症起病隐匿，在进行性发展中造成神经系统的退行性病变，是老年痴呆症最主要的发病形式。AD发病的主要原因之一是淀粉样β蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)的大量产生和聚集形成纤维，在这个过程中富集吸附多种金属离子，最终形成老年斑(senileplaque,SP)，对神经元细胞产生较高的毒害作用。Aβ是淀粉样前体蛋白(amyloid-βprecursorprotein,APP)经由β和γ分泌酶切割而形成的含有39-43个氨基酸残基的多肽。Aβ的两种主要类型为Aβ40和Aβ42，其中Aβ40含量最为丰富。研究表明Aβ单体在水溶液条件下呈现无规则卷曲结构，在聚集形成纤维的过程中首先通过构象转变形成富含β-折叠的二级结构，然后通过分子间疏水相互作用、氢键、盐键等作用力聚集在一起逐渐形成成熟纤维。在聚集过程中形成的可溶性Aβ寡聚体和原纤维是最具神经毒性的。同时，Aβ还具有络合金属离子的能力，在AD患者大脑组织中的老年斑内发现Cu2+、Zn2+、Fe3+、Al3+发生富集，老年斑周围的脑组织中多种金属离子浓度升高。其中Aβ-Cu2+络合体由于能够促进Aβ聚集和催化产生氧化自由基粒子(radicaloxygenspecies,ROS)，因此会造成神经元细胞氧化压力的增大，导致细胞死亡。针对Aβ聚集产生有毒聚集体，研究者开发了诸多能够有效抑制Aβ聚集的抑制剂，如：姜黄素、EGCG、多肽、抗体等以及纳米粒子抑制剂。由于Aβ的疏水核心序列对于Aβ的聚集具有重要作用，因此研究者基于此多肽设计开发了一系列具有明显抑制Aβ聚集效果的多肽抑制剂。但研究表明在体内，Aβ聚集过程中常会伴随金属离子的络合，因此近些年来许多研究者致力于开发双功能的Aβ聚集抑制分子，使其既能够螯合金属离子，又能抑制Aβ聚集。本专利技术是在先前Aβ聚集抑制短肽LVFFARK的基础上，通过在其C末端添加能够络合Cu2+的螯合片段HH设计成的双功能短肽抑制剂，可以实现抑制Aβ聚集和鳌合金属离子双功能，为开发新型药物提供新的设计思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发抑制Aβ聚集毒性的新型抑制剂，提出设计合成一种既能够抑制Aβ40蛋白聚集，降低Aβ40蛋白造成的神经细胞毒性，又能降低Aβ-Cu2+络合体催化产生ROS速率的一种新的双功能短肽抑制剂(Ac-LKFFARKHH-NH2)，以及其抑制淀粉样β蛋白聚集和相关细胞毒性方面的应用。本专利技术的技术方案如下：一种抑制淀粉样β蛋白聚集的双功能短肽抑制剂；其氨基酸序列为：Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Arg-Lys-His-His。本专利技术的抑制淀粉样β蛋白聚集的双功能短肽抑制剂抑制Cu2+存在下β-淀粉样蛋白聚集及其相关细胞毒性的应用。应用为双功能短肽与β-淀粉样蛋白摩尔浓度比优选为1:1。抑制淀粉样β蛋白聚集的双功能短肽抑制剂用于阿尔兹海默症药物和保健品开发方面的用途。抑制淀粉样β蛋白聚集的双功能短肽抑制剂用于用于阿尔兹海默症的药物的原料药。本专利技术设计合成的双功能短肽抑制剂是基于Aβ的疏水核心序列(KLVFFAE)得到的一个九肽，本身具有抑制Aβ聚集的能力；端基乙酰化和酰胺化之后，具有降低多肽在血浆中的代谢速度和增强穿透血脑屏障的能力；带正电荷HH的引入，增大了多肽间的排斥力，不利于多肽自身的聚集，同时可以螯合Cu2+，降低由Aβ-Cu2+络合体催化产生的ROS对细胞的影响。因此使之成为具有前景的治疗AD的候选药物。本专利技术的优点：多种实验手段证明，双功能短肽抑制剂与Aβ40蛋白摩尔浓度比在1:1时，就能够有效地抑制了Aβ40纤维的生成，并且抑制Aβ-Cu2+络合体催化产生ROS的速率，最终大幅降低了Aβ40的聚集和络合金属Cu2+所带来的细胞毒性作用，是Aβ40聚集和神经细胞氧化压力的有效抑制剂。附图说明图1：不同浓度的双功能短肽抑制剂与Aβ40共培养72h后的ThT荧光强度变化；图2：摩尔浓度比为1:0.4:1的Aβ40、Cu2+和双功能短肽抑制剂共培养的ThT荧光动力学；图3：摩尔浓度比为1:0.4:1的Aβ40、Cu2+和双功能短肽抑制剂共培养的培养物形貌(图3C)，其中图3A为单独培养Aβ40形成的聚集体的形貌，图3B为摩尔浓度比为1:0.4的Aβ40和Cu2+共同培养形成的聚集体的形貌。图4：双功能短肽抑制剂对Aβ-Cu2+络合体催化产生·OH生成速率的影响；图5：Aβ40与Cu2+和双功能短肽抑制剂按摩尔比1:0.4:1共培养24h后培养物对PC-12细胞存活率的影响。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。我们通过多种物理化学生物的检测手段证实双功能短肽抑制剂可以有效抑制Aβ40聚集和抑制Aβ-Cu2+络合体催化产生ROS的速率，最终降低Aβ40的聚集和络合金属Cu2+所带来的细胞毒性作用。双功能短肽抑制剂氨基酸序列：Ac-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Arg-Lys-His-His-NH2双功能短肽抑制剂结构式：实施例1：不同浓度双功能短肽抑制剂与Aβ40共培养72h后的ThT荧光强度变化首先将储存于-80℃冰箱的Aβ40置于室温下，待其温度升至室温，称取Aβ40粉末以1mg/mL的浓度溶于纯六氟异丙醇；将此溶液在-4℃下静置2h，待其完全溶解后超声2min以打散Aβ40聚集体；将超声后的Aβ40溶液于4℃，16000g离心20min，取上清的75％；将取出的75％上清液在-80℃冰箱内冻实4h以上，随后冷冻干燥24h，得到预处理好的蓬松棉絮状的Aβ40，置于-20℃下保存。溶液配制如下：称取2.2mgAβ40溶于2mL20mMNaOH溶液中，配制成终浓度为250μM的Aβ母液，冰浴超声处理20min，使其完全溶解；称取8mg的ThT溶于1LHEPES缓冲液(20mMHEPES,NaCl100mM，pH＝7.4)中，使其浓度为25μM；称取0.47mg的双功能短肽抑制剂溶于200mLDMSO中，使其浓度为2mM。利用HEPES缓冲液进行稀释，使各实验组均含有Aβ4025μM，双功能短肽抑制剂的浓度分别为0μM、12.5μM、25μM、50μM和100μM。用漩涡混合器混合均匀，将在37℃，150rpm条件下震荡共培养72h。检测时用ThT染液将培养液稀释20倍后，测定ThT荧光强度。以仅含Aβ的样品为100％，无Aβ与抑制剂的缓冲液为0进行归一化，绘制ThT荧光强度百分比随时间的变化曲线，每个实验点取三次重复实验的平均值。荧光光度计仪器参数：激发波长440nm(激发带宽5nm)；发射波长480nm(发射带宽5nm)。结果如图1所示。由图1可知，加入双功能短肽抑制剂双功能短肽抑制剂后Aβ40的ThT荧光强度明显下降，说明双功能短肽抑制剂能有效抑制Aβ40的聚集。ThT荧光强度下降程度与双功能短肽抑制剂的浓度呈正比，说明双功能短肽抑制剂浓度越高，其抑制Aβ40聚集效果越好。实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制淀粉样β蛋白聚集的双功能短肽抑制剂；其特征是氨基酸序列为：Leu‑Val‑Phe‑Phe‑Ala‑Arg‑Lys‑His‑His。

【技术特征摘要】
1.一种抑制淀粉样β蛋白聚集的双功能短肽抑制剂；其特征是氨基酸序列为：Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Arg-Lys-His-His。2.权利要求1的抑制淀粉样β蛋白聚集的双功能短肽抑制剂抑制Cu2+存在下β-淀...

【专利技术属性】
技术研发人员：董晓燕，张冲，余林玲，孙彦，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12