一种多肽的制备方法技术

本发明专利技术涉及多肽领域，特别涉及一种多肽的制备方法。该制备方法包括如下步骤：取Arg与树脂偶联，制得Arg-树脂；取Arg-树脂，逐个偶联Ala、Arg、Arg、Arg、Ala、Cys(X)后，将氮端氨基乙酰化，得到第一肽树脂；脱除第一肽树脂中Cys(X)的侧链保护基X，再与Y-Cys偶联，获得第二肽树脂，裂解，即得。该方法为纯固相工艺，操作简便，假稀释效应避免了液相反应中存在的多肽链间二硫键错配的反应(不会产生肽链间反应)。提高了多肽Velcalcetide的收率和纯度，减少了副反应的发生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽领域，特别涉及一种多肽的制备方法。
技术介绍
Velcalcetide，也称AMG416，氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，结构如式Ⅰ所示。Velcalcetide用于接受透析的慢性肾病患者的继发性甲状旁腺功能亢进。这个药物目前正在进行III期研究，预期2014年下半年将公布研究数据。安进公司目前已经有一个同一适应症药物在市场上销售，名为Sensipar。去年，这个药物的销售额同比增长14.6％，达到10.9亿美元。Velcalcetide可以在进行血液透析的同时通过静脉给药，这对于每天都需要使用大量药物的慢性肾病患者来说是一个福音。因此，velcalcetide很有可能会超过它的前任Sensipar。分析师预期velcalcetide的年销售峰值出现在2023年，为10亿美元。目前未见合成方法的报道，更未见大规模合成的方法。因此，提供Velcalcetide的制备方法具有现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种多肽的制备方法。该方法为纯固相工艺，操作简便，假稀释效应避免了液相反应中存在的多肽链间二硫键错配的反应(不会产生肽链间反应)。提高了多肽Velcalcetide的收率和纯度，减少了副反应的发生。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种多肽的制备方法，包括如下步骤：步骤1：取Arg与树脂偶联，制得Arg-树脂；<br>步骤2：取所述Arg-树脂，逐个偶联Ala、Arg、Arg、Arg、Ala、Cys(X)后，将氮端氨基乙酰化，得到第一肽树脂；步骤3：脱除所述第一肽树脂中Cys(X)的侧链保护基X，再与Y-Cys偶联，获得第二肽树脂，裂解，即得。具体的，本专利技术提供的多肽的制备方法中，步骤2具体为取所述Arg-树脂(具体为D-Arg(pbf)-Resin)，逐个偶联D-Ala、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D-Ala、D-Cys(X)，将氮端氨基乙酰化后，得到第一肽树脂为Ac-D-Cys(X)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Resin。具体的，本专利技术提供的多肽的制备方法中，第二肽树脂为在本专利技术的一些实施例中，Cys的侧链保护基所述X为mmt或mtt。适于做侧链保护基的均在本专利技术的保护范围之内，本专利技术在此不做限定。作为优选，Cys含有特殊的侧链保护基Npys，一方面防止合成原料之间的二硫键合成，另一方面Npys属于良好的离去基团，能有效提高原料与链间Cys的偶联。在本专利技术的一些实施例中，步骤3中所述脱除选用体积浓度为1％～5％TFA的DCM溶液，即1％～5％TFA/DCM。在本专利技术的一些实施例中，所述Y为Fmoc、Boc或H。适于做保护基的均在本专利技术的保护范围之内，本专利技术在此不做限定。在本专利技术的一些实施例中，当所述Y为Fmoc时，步骤3中所述获得第二肽树脂与所述裂解之间还包括脱除Y的步骤。当所述Y为Boc或H时，不需要先脱除。在本专利技术的一些实施例中，所述脱除Y选用的脱除剂为体积浓度为20％哌啶的DMF溶液，即20％哌啶/DMF。作为优选，步骤3中的偶联反应条件是空气氧化。在本专利技术的一些实施例中，步骤3中所述裂解采用的裂解液包括TFA、PhSMe、EDT、TIS和H2O的混合物。作为优选，TFA、PhSMe、EDT、TIS和H2O的体积比为83:5:5:5:2。在本专利技术的一些实施例中，步骤1中所述树脂为氨基树脂，所述氨基树脂选自RinkAmideResin、RinkAmide-MBHAResin或RinkAmide-AMResin。在本专利技术的一些实施例中，步骤3所述裂解后还包括纯化的步骤。作为优选，Fmoc-D-Arg-Resin的替代度为0.2～0.5mmol/g。作为优选，树脂与Fmoc-D-Arg(pbf)的摩尔比为1.6:1-4:1。作为优选，偶联剂为HOBt/DIC。作为优选，反应后经封闭液封闭8h，封闭液中吡啶与乙酸酐的摩尔比为1:1。在本专利技术的一些实施例中，Fmoc-D-Arg-树脂与Fmoc-D-Ala-OH的摩尔比至少为1:3，优选的，Fmoc-D-Arg-树脂与Fmoc-D-Ala-OH的摩尔比为1:3。在本专利技术的一些实施例中，以g/mL计，树脂与裂解液的质量体积比为1:10。作为优选，裂解剂中TFA/PhSMe/EDT/TIS/H2O的体积比为83:5:5:5:2。在本专利技术的一些实施例中，粗肽精制成时，加入的酸为硫酸胺、三氟乙酸或醋酸。作为优选，硫酸胺的浓度为0.05％，pH值为2.5。作为优选，三氟乙酸的浓度为0.1％。作为优选，醋酸的浓度为0.1％。本专利技术提供一种多肽的制备方法。该方法为纯固相结合进行大规模制备的Velcalcetide路线，利用固相的假稀释效应避免了液相反应中存在的多肽链间二硫键错配的反应。具体为采用了特殊的合成原料Boc-Cys(Npys)-OH或Fmoc-Cys(Npys)-OH或H-Cys(Npys)-OH，含有特殊的侧链保护基Npys，一方面防止合成原料之间的二硫键合成，另一方面Npys属于良好的离去基团，能有效提高原料与链间Cys的偶联。提高了多肽Velcalcetide的收率和纯度，减少了副反应的发生。附图说明图1示实施例13制备的精肽的RT-HPLC色谱图；图2示实施例13制备的精肽的质谱图；图3示多肽Velcalcetide标准品的质谱图。具体实施方式本专利技术公开了一种多肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的多肽的制备方法中所用氨基酸及试剂均可由市场购得。缩写及英文含义缩写及英文含义Fmoc9-芴甲氧羰基DIPCDI二异丙基碳二亚胺HOBt1-羟基苯并三唑DMFN,N-二甲基甲酰胺DCM二氯甲烷TFA三氟乙酸PhSMe苯甲硫醚TIS三异丙基硅烷EDT乙二硫醇Boc-Cys(Npys)-OHBoc-S-(3-硝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：取Arg与树脂偶联，制得Arg‑树脂；步骤2：取所述Arg‑树脂，逐个偶联Ala、Arg、Arg、Arg、Ala、Cys(X)后，将氮端氨基乙酰化，得到第一肽树脂；步骤3：脱除所述第一肽树脂中Cys(X)的侧链保护基X，再与Y‑Cys偶联，获得第二肽树脂，裂解，即得。

【技术特征摘要】
1.一种多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取Arg与树脂偶联，制得Arg-树脂；
步骤2：取所述Arg-树脂，逐个偶联Ala、Arg、Arg、Arg、Ala、Cys(X)
后，将氮端氨基乙酰化，得到第一肽树脂；
步骤3：脱除所述第一肽树脂中Cys(X)的侧链保护基X，再与Y-Cys偶
联，获得第二肽树脂，裂解，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述X为mmt或
mtt。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述脱除选
用体积浓度为1％～5％TFA的DCM溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Y为Fmoc、Boc
或H。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述Y为Fmoc时，
步...

【专利技术属性】
技术研发人员：宓鹏程，刘建，马亚平，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44