一种多肽二硫键的定位方法技术

本发明专利技术公开了一种多肽二硫键的定位方法，包括：将待测多肽在含二硫键还原剂的溶液环境中部分还原化；对部分还原化的多肽在含多肽变性剂和烷基化试剂的溶液环境中烷基化；对烷基化的多肽在含多肽变性剂和二硫键还原剂的溶液环境中完全还原化；使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对产物进行分子量检测；对检测合格的样品进行液质联用串联质谱检测，得到质谱数据；将质谱数据转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，然后使用质谱鉴定软件将质谱数据与参考多肽序列数据库进行搜索比对，计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。该方法样本量需求小、纯度要求较低、操作简单、重现性高、解析难度小、结果准确度高、通量高且成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽的结构测定
，尤其涉及一种多肽二硫键的定位方法。
技术介绍
二硫键是一种广泛存在于天然蛋白质和多肽中的常见翻译后修饰，共价交联于两个半胱氨酸之间(仇晓燕，崔勐，刘志强，刘淑莹.蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析.化学进展.第20卷,第6期,975-983)。二硫键的形成对于蛋白质和多肽的空间结构(Wedemeyer W J，Welker E，Narayan M，Scheraga H A.Biochemistry.2000，39：4207-4216)、维持正确的折叠构象(Pitt J J，da Silva E，Gorman J J.J.Bio1.Chem.，2000，275:6469-6478)、保持及调节其生物活性(Abkevich V I，Shakhnovich E I.J.Mo1.Bio1.，2000，300:975-985)等都起着至关重要的作用。因此，对蛋白质和多肽中二硫键的定位，即二硫键的具体连接位置以及不同二硫键之间的组合排列关系，具有重要意义，有助于蛋白质和多肽的功能活性研究和结构解析，也为蛋白多肽类药物开发和改进奠定了重要基础。对于二硫键定位，传统的研究方法有以下几种：X射线晶体衍射法(Hart P J，Deep S，Taylor A B，et a1.Nat.Struct.Bio1.，2002，9：203-208)、核磁共振法(Fadel V，Bettendoif P，Herrmann T，et a1.Toxicon，2005，46：759-767)、对角线电泳法(Brown J R，Hartley B S.Biochem.J.，1966，101：214-228)、HPLC分离法(Stewart A E，Raffioni S，Chaudhary T，Chait B T，Lupofini P，Bradshaw R A.Protein Sci.，1992.1：777-785)、Edman降解(Haniu M，Acklin C，Kenney W C，Rohde M F.Int.J.Pept.Protein Res.，1994，43：81-86)和氨基酸序列分析法(Akashi S，Hirayama K，Seino T，et a1.Biomed.Environ MassSpectrom.1988，15：541-546)等，但是这些方法各存在一些缺点和需要解决的问题。X射线晶体衍射法依赖于很高纯度的蛋白多肽，对样品量需求大，且需要形成高度有序的晶体结构。后来发展的核磁共振(NMR)可以在近似自然生理条件状态的溶液中检测样品，但是需要的样品量更大，且通常谱图复杂，解谱难度大。经典的对角线电泳法主要基于将为还原二硫键的样品进行酶切，然后
通过第一向和第二向电泳，使含有二硫键的酶切片段偏离对角线，然后取下进行氨基酸序列分析，这种方法同样需要较大样本量，且分辨率低，检测精度差。类似基于分离原理的方法还有HPLC法，具有同样的缺点和问题。Edman降解法是操作相对简单且检测结果相对准确的一种方法，但是仍然需要样本量较大，纯度很高的样品才能满足要求。随着质谱技术的发展，由于质谱具有样本量用量少，检测快速，耐受度高，通量高等优点，结合质谱检测，利用质谱鉴定的方法越来越多。如酶切、分离后进行质谱分子量测定从而推导二硫键连接位置，或者通过同位素标记或生物衍生后再进行质谱分子量检测。但是这种方法依然存在假阳性高和准确性低的问题，尤其是存在两个或两个以上相邻半胱氨酸的情况下，无法判断二硫键的位置。利用部分还原法结合二级质谱(MS/MS)解析多肽二硫键定位的方法也已有报道(中国专利技术专利CN 102721734 B)，但是该方法的样本处理过程仍然是较复杂的部分，上样量要求较大(2mg)，样品纯度要求较高，还原后需要经过高效液相色谱(HPLC)进行分离纯化，部分还原烷基化需要在高温条件下进行，质谱数据质量较差，手工分析因素很大，导致结果的可控性和可重复性差，并且只能得到定性结果而难以得到定量结果，不易同时对大量不同的样品进行高通量分析。总之，现有的基于部分还原法结合二级质谱解析多肽二硫键定位的方法存在样本量需求大、纯度要求高、操作复杂、重现性低、解析难度大、通量低、结果准确度低、成本高和检测周期长的问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种样本量需求小、纯度要求较低、操作简单、重现性高、解析难度小、结果准确度高、通量高且成本低的多肽二硫键的定位方法，该方法可获得多肽的二硫键连接位置以及不同二硫键连接组合方式之间的存在比例关系。本专利技术的方法是通过如下技术方案实现的：一种多肽二硫键的定位方法，该方法包括：1)将含有二硫键的待测多肽在含二硫键还原剂的溶液环境中进行部分还原化处理，得到部分还原化的待测多肽；2)对上述部分还原化的待测多肽在含多肽变性剂和烷基化试剂的溶液环境中进行烷基化处理，得到部分还原烷基化的待测多肽；3)对上述部分还原烷基化的待测多肽在含多肽变性剂和二硫键还原剂的溶液环境中进行完全还原化处理；4)使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对步骤3)的产物进行样品的分子量检测，若出现部分还原状态对应分子量的质谱峰即为合格；5)对上述合格的样品进一步进行液质联用串联质谱检测，得到用于质谱分析的质谱数据；6)将上述质谱数据转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，然后使用质谱鉴定软件将转换好格式的质谱数据与参考多肽序列数据库进行搜索比对，得到各种不同位置半胱氨酸残基烷基化修饰位点的多肽鉴定信息，根据多肽的序列、修饰位点、强度、色谱出峰时间及组合，精确计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。本专利技术中，上述液质联用串联质谱可以采用LC-MS/MS质谱仪进行，优选Orbitrap质量分析器类型质谱仪，更优选Q-Exactive质谱仪，采用一级质谱和二级质谱串联检测模式。本专利技术中，上述质谱鉴定软件可以选用Mascot、Maxquant、Sequest、X！tandem或OMSSA软件，优选Mascot软件。作为本专利技术的优选技术方案，上述步骤1)中的二硫键还原剂选自二硫苏糖醇或三(2-氯乙基)磷酸酯。作为本专利技术的优选技术方案，上述溶液环境中的含有二硫键的待测多肽的浓度为0.01～10μg/μL，优选为0.1～1μg/μL。作为本专利技术的进一步改进的技术方案，如果上述二硫键还原剂为二硫苏糖醇，上述溶液环境为双蒸水溶液，上述二硫苏糖醇的终浓度为1～100mmol/L，上述部分还原化处理的温度为15～30℃、时间为5～30min；如果上述二硫键还原剂为三(2-氯乙基)磷酸酯，上述溶液环境为柠檬酸溶液，上述三(2-氯乙基)磷酸酯的终浓度为0.01～10mmol/L，上述部分还原化处理的温度为15～30℃、时间为5～30min。作为本专利技术的优选技术方案，上述步骤2)中的多肽变性剂选自尿素、盐酸胍或硫脲；优选地，上述多肽变性剂的浓度为6～8mol/L。作为本专利技术的优选技术方案，上述烷基化试剂选自碘代乙酰胺；优选地，上述碘代乙酰胺的浓度为10～550mmol/L。作为本专利技术的进一步改进的技术方案，上述烷基化处理在避光下进行，温
度为15～30℃、时间为30min以上。作为本专利技术的优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述方法包括：1）将含有二硫键的待测多肽在含二硫键还原剂的溶液环境中进行部分还原化处理，得到部分还原化的待测多肽；2）对所述部分还原化的待测多肽在含多肽变性剂和烷基化试剂的溶液环境中进行烷基化处理，得到部分还原烷基化的待测多肽；3）对所述部分还原烷基化的待测多肽在含多肽变性剂和二硫键还原剂的溶液环境中进行完全还原化处理；4）使用基质辅助激光解吸电离‑飞行时间质谱对步骤3）的产物进行样品的分子量检测，若出现部分还原状态对应分子量的质谱峰即为合格；5）对所述合格的样品进一步进行液质联用串联质谱检测，得到用于质谱分析的质谱数据；6）将所述质谱数据转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，然后使用质谱鉴定软件将转换好格式的质谱数据与参考多肽序列数据库进行搜索比对，得到各种不同位置半胱氨酸残基烷基化修饰位点的多肽鉴定信息，根据多肽的序列、修饰位点、强度、色谱出峰时间及组合，精确计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。

【技术特征摘要】
1. 一种多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述方法包括：1）将含有二硫键的待测多肽在含二硫键还原剂的溶液环境中进行部分还原化处理，得到部分还原化的待测多肽；2）对所述部分还原化的待测多肽在含多肽变性剂和烷基化试剂的溶液环境中进行烷基化处理，得到部分还原烷基化的待测多肽；3）对所述部分还原烷基化的待测多肽在含多肽变性剂和二硫键还原剂的溶液环境中进行完全还原化处理；4）使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对步骤3）的产物进行样品的分子量检测，若出现部分还原状态对应分子量的质谱峰即为合格；5）对所述合格的样品进一步进行液质联用串联质谱检测，得到用于质谱分析的质谱数据；6）将所述质谱数据转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，然后使用质谱鉴定软件将转换好格式的质谱数据与参考多肽序列数据库进行搜索比对，得到各种不同位置半胱氨酸残基烷基化修饰位点的多肽鉴定信息，根据多肽的序列、修饰位点、强度、色谱出峰时间及组合，精确计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。2. 根据权利要求1所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述液质联用串联质谱采用LC-MS/MS质谱仪进行，优选Orbitrap质量分析器类型质谱仪，更优选Q-Exactive质谱仪，采用一级质谱和二级质谱串联检测模式。3. 根据权利要求1所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述质谱鉴定软件选用Mascot、Maxquant、Sequest、X!tandem或OMSSA软件，优选Mascot软件。4. 根据权利要求1-3任一项所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述步骤1）中的二硫键还原剂选自二硫苏糖醇或三(2-氯乙基)磷酸酯。5. 根据权利要求4所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述溶液环境中的含有二硫键的待测多肽的浓度为0.01~10μg/μL，优选为0.1~1μg/μL。6. 根据权利要求5所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，如果所述二硫键还原剂为二硫苏糖醇，所述溶液环境为双蒸水溶液，所述二硫苏糖醇的终浓度为1~100mmol/L，所述部分还原化处理的温度为15~30℃、时间为5~30min；如果所述二硫键还原剂为三(2-氯乙基)磷酸酯，所述溶液环境为柠檬酸溶液，所述三(2-氯乙基)磷酸酯的终浓度为0.01~10mmol/L，所述部分还原化处理的温度为15~30℃、时间为5~30min。7. 根据权利要求1-3任一项所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述步骤2）中的多肽变性剂选自尿素、盐酸胍或硫脲；优选地，所述多肽变性剂的浓度为6~8mol/L；优选地，所述烷基化试剂选自碘代乙酰胺；优选地，所述碘代乙酰胺的浓度为10~550mmol/L；优选地，所述烷基化处理在避光下...

【专利技术属性】
技术研发人员：林志龙，刘杰，闻博，冯强，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44