一种结核病检测多肽及其应用制造技术

本发明专利技术的结核特异性检测多肽，其多肽序列为SEQ ID NO.1所示，应用于结核病的血清学检测，敏感性高、特异性强；同时兼顾了血清学检测方法简单、快速，价格便宜的特点，不需要特殊的大型检测设备，使得基层医院也能够广泛开展高敏感性的结核病检测；同时，本发明专利技术的结核特异性检测多肽对痰涂片阴性的肺结核，肺外结核和不易获得痰标本的儿童结核的诊断均具有重要价值；另外，本发明专利技术的结核特异性检测多肽的特异性抗体及其在制备结核检测试剂盒中应用对结核病检测领域同样意义重大。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及结核病检测领域，尤其涉及一种结核检测多肽及其应用。
技术介绍
由人结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)所引起的结核病是严重危害人类健康的传染病。结核病是WHO重点控制的传染性疾病，目前仍是严重危害人民健康的公共卫生问题。据有关资料统计，全球约有1/3的人口感染结核菌，现有结核病人约2000万，每年新发病800万～1000万人，每年约有200万人死于结核病，是其它所有传染病死亡人数的总和。我国的结核病疫情极其严峻，现有结核感染者5亿，占全球的1/4，每年有13万人死于结核病，为其它各类传染病和寄生虫病死亡人数总和的2倍。近二、三十年来由于人口流动，耐药结核菌传播，艾滋病等因素影响，结核病疫情在全球范围内回升。如今已成为所有传染病中的最大死亡原因(已经超过了狂犬病)，成为青年人的第一杀手。目前结核病控制存在的最主要问题是病人发现率低，治愈率低。在诊断方面，现有的检查方法均存在着一定的局限性，难以达到快速、准确的结核病诊断。因此，加大结核分枝杆菌的基础研究，寻找快速、灵敏、简便、实用的结核病诊断新方法，提高结核病人的检出率，是目前结核病研究需要迫切解决的问题。血清学检查是目前结核病实验室三大诊断方法之一，相对细菌学和分子生物学检查具有多种优点，其方法简单、快速，价格便宜，不需要特殊的大型检测设备，即使基层医院也能够广泛开展，对痰涂片阴性的肺结核，肺外结核和不易获>得痰标本的儿童结核的诊断均具有重要价值，成为了早期发现与诊断结核病的理想选择。结核病的常规血清学检查存在着敏感性、特异性较低的缺点，限制了临床应用，主要原因是难以得到高敏感性、高特异性的检测标识物。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的一种高特异性、高敏感性结核病检测多肽，以及相关的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种结核特异性检测多肽，其多肽序列为SEQIDNO.1所示。通过对病人和健康人血清或血浆样本中的小分子多肽进行分离富集，采用4800PlusMALDITOF/TOFTM质谱仪对不同样本中的多肽分子进行鉴定，获得在不同样本的分布具有显著性差异的多肽分子，通过数据分析比较，我们发现如SEQIDNO.1所示多肽分子P1可以有效区分结核病人和健康人的血清或者血浆样本，在结核病人血清或者血浆中的含量显著低于健康人，进一步利用数据库对该多肽来源的蛋白――凝集素进行血清标本的检测发现，结核病人血清中凝集素的含量显著高于健康人，利用该蛋白可以有效区分结核病人和健康对照，可用于结核病的血清学检测。另一方面，本专利技术还提供一种检测结核病的试剂盒，将上述的结核特异性检测多肽作为检测标识物。同时，本专利技术还提供一种上述的结核特异性检测多肽的特异性抗体。另一方面，本专利技术还包括上述特异性抗体在制备结核检测试剂盒中的应用。本专利技术的结核特异性检测多肽，应用于结核病的血清学检测，敏感性高、特异性强；同时兼顾了血清学检测方法简单、快速，价格便宜的特点，不需要特殊的大型检测设备，使得基层医院也能够广泛开展高敏感性的结核病检测；同时，本专利技术的结核特异性检测多肽对痰涂片阴性的肺结核，肺外结核和不易获得痰标本的儿童结核的诊断均具有重要价值。附图说明图1为结核特异性检测多肽P1在不同标本中质谱检测的响应值(A为血清标本；B为血浆标本)；图2为凝集素在不同血清标本中的ELISA检测结果。具体实施方式本专利技术提供了一种结核特异性检测多肽，其多肽序列为SEQIDNO.1所示。下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本专利技术范围。实施例1：结核病人血清血浆特异性多肽的鉴定1实验材料1.1纳米孔芯片纳米孔(Nanoporous，NPS)硅薄膜芯片由美国卫理公会医院研究所的胡晔教授馈赠，是一种孔径在1～100nm且具有显著表面效应的多孔材料，不同孔径的纳米孔可以特异性吸附、分离小分子蛋白或多肽。1.2结核病人，疾病对照及健康人血清20例结核病人血清、血浆标本采集自上海市肺科医院结核科门诊或住院的结核病人，均为结核分枝杆菌培养阳性；20例非结核性疾病对照血清采集自上海市肺科医院呼吸科门诊确诊的非结核病性呼吸系统疾病病人；23例健康人血清、血浆采集自上海市肺科医院门诊体检的健康华东汉族人，均有卡介苗接种史。所有人选均排除了合并糖尿病、自身免疫性疾病及HIV感染。血清、血浆标本采集后分装，－80℃冻存。1.3主要化学试剂乙腈(Acetonitrile，ACN)，三氟乙酸(Trifluoroaceticacid，TFA)，基质α－氰基－4－羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamicacid，CHCA)购自美国Sigma公司；CultureWellTM分隔盖玻片购自美国lifetechnologies公司；标准多肽购自德国BrukerDaltonics公司。1.4主要仪器AB4800MALDI-TOF系统(美国ABI公司)；全自动高压灭菌器(日本Hirayama公司)；超纯水分离系统(英国USFElga公司)；普通离心机(德国eppendorf公司)；深低温冰箱(美国ThermoScientific公司)。2方法及结果2.1血清、血浆标本的预处理用去离子配制含50％ACN和0.1％TFA的样本稀释液，取2.8μl加入到分装离心后的25μl血清、血浆标本中，使ACN的终浓度为5％，TFA为0.01％，混匀后，置于桌面式漩涡振荡仪室温混合30分钟。2.2血清、血浆标本中多肽的分离提纯2.2.1在160℃烤箱中预先过夜烘烤纳米孔芯片，或者将芯片贮存在干燥器中直到使用，以避免空气中水分子对芯片表面的水合作用。2.2.2使用压缩空气抹掉可能附着在芯片表面的任何微粒。2.2.3按照检测样本数量，裁剪包含相同数量检测孔的CultureWell分隔盖玻片100％乙醇清洁后，用镊子将盖玻片放置于芯片表面，并保证盖玻片与芯片的紧密贴合。2.2.4用移液器吸取预处理的血清或血浆样本5μL分别加入到盖玻片3mm孔中，每个样品制备2复孔，室温湿盒中孵育30分钟。2.2.5用移液器吸取孔中残留的样本，加入10μL去离子水至各孔中进行冲洗，重复4次。2.2.6为了模仿生物样品的复杂度及评估小分子量多肽的富集效率，我们选取了一些已知分子量和浓度的标准多肽作为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核特异性检测多肽，其特征在于，其多肽序列为SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种结核特异性检测多肽，其特征在于，其多肽序列为SEQIDNO.1所示。
2.一种检测结核病的试剂盒，其特征在于，将如权利要求1所述的结核特异性
检...

【专利技术属性】
技术研发人员：戈宝学，杨华，刘忠华，郑瑞娟，黄晓辰，
申请(专利权)人：上海市肺科医院，
类型：发明
国别省市：上海;31