本发明专利技术涉及一种用于制备在抗癌免疫疗法中使用的施用于人受试者的疫苗制剂的方法，该疫苗制剂具有包含三个表位的优化多肽和作为佐剂的Montanide。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及抗癌疫苗领域。更具体地说，本专利技术涉及一种用于制备在抗癌免疫疗法中使用的疫苗制剂的方法，该疫苗制剂具有优化的多肽(包含三个表位)和作为佐剂的Montanide。WO2007073768(A1)公开了具有序列Vx006(YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL，SEQ ID NO:1)的多肽，其包含三个通用肿瘤抗原衍生的优化隐蔽性肽(TERT988Y、MAGE-A248V9和HER-2/neu402Y)。与三种肽的简单混合物不同，并且与包含相同表位但顺序不同的其它多肽不同，SEQ ID NO:1的多肽引发针对由肿瘤细胞表达的天然表位TERT988、HER-2/neu402、MAGE-A248G9和MAGE-A248D9的多特异性CTL应答。由于几乎100％的肿瘤表达三种抗原中的至少一种，从而Vx006成为用于抗癌免疫疗法的出色候选物。免疫佐剂是被添加至疫苗制剂以提高其功效的物质。佐剂可以提高由疫苗接种而诱导的免疫应答的强度和持续时间。IFA(不完全弗氏佐剂)是在研究中最常用的佐剂之一。它是从不可代谢油制备。具有IFA的疫苗制剂是油包水(W/O)乳液。IFA通过在注射部位形成储库和刺激产生浆细胞的抗体来诱导免疫应答。然而，不良反应，包括在许多情况下需要手术介入的无菌性脓肿和一些临床前的发现表明，IFA是使实验室动物致癌的，其妨碍了IFA佐剂疫苗的进一步临床开发。于是，具有改进的规格和质量控制步骤的IFA型解毒佐剂变得可用。例如，基于矿物油的ISA 51和基于角鲨烯的ISA 720(SEPPIC，France)乳液目前正处于针对癌症、疟疾和HIV的疫苗研究的临床研发中。但是，因为W/O型乳液存留在注射部位，在该注射部位其倾向于引起局部反应，这些W/O乳液佐剂的应用可能仍限于人类的治疗性疫苗和癌症疫苗领域。针对非小细胞肺癌的疫苗，使用ISA51VG的EGF疫苗，正在进行三期研究，并已经至少在古巴获得许可。ISA 51是高度纯化的矿物油(Drakeol 6VR)和表面活性剂(二缩甘露醇单油酸酯)的混合物。在2006年，出于对朊病毒污染的顾虑，ISA 51的制剂从使用由牛油中分离的油酸改变为使用由橄榄分离的油酸(ISA 51VG)。用于执行油包水(W/O)乳化的疫苗的方法可通过多种程序使用不同装置如高剪切混合器、旋涡、注射器或注射器和连接器(T-或I-连接器)来获得。用于获得乳液的方法就疫苗的物理-化学参数和疫苗接种功效而言不是所有都为相同的。传统上，为了获得用ISA 51乳化的肽，使用由连接器(I或T-连接器)连接的两个无硅酮注射器以带来高剪切从而使水滴被捕获在周围油相中。通常情况下，肽溶解在生理盐水溶液中(最通常为PBS或0.9％NaCl盐水缓冲液)，一体积的该溶液与一体积的ISA 51混合。然后将混合物装载至由例如通过I-连接器连接的两个无硅酮注射器组成的装置中，其用于执行20个低速循环(即循环持续大约4秒)的预乳化步骤，随后执行40个快速循环的乳化步骤。如下定义循环：使整个溶液(水相和佐剂)从第一个注射器转移至另一个，随后使整个溶液转移返回其初始注射器。近来，Ascarateil和Koziol报告了通过优化的用于自动W/O乳液过程的新设备获得的结果(Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2013)。在专利申请EP 2 322 132 A1中公开的这种装置是自动封闭系统，其允许控制乳化过程。本专利技术人试图通过上述的通常程序用ISA 51和包含SEQ ID No:1的多肽的水相获得W/O乳液。当这样做时，专利技术人遇到了一些不明原因的困难，如以下实验部分示出的。由于用于用肽溶液和获得乳液的标准程序失败了，专利技术人在乳化过程中尝试了多个参数，但没有成功。最后，专利技术人令人惊讶地发现，仅当满足下列两个条件时，ISA 51VG才能够乳化SEQ No:1的多肽：-SEQ No:1的多肽必须溶解在纯水而不是盐溶液中；和-预乳化步骤必须包括至少2个非常慢的循环，每个循环持续至少6秒。因此，本专利技术涉及一种用于获得油包水乳液的方法，所述油包水乳液用于向人受试者施用序列YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL(SEQ ID No:1)的多肽，所述方法包括以下步骤：(i)通过使冻干的SEQ No:1的多肽溶解于纯水(注射用水)中来获得抗原水相；(ii)将一体积的所述抗原水相和一体积的ISA 51装载至包括由连接器连接的两个注射器的装置中；(iii)通过执行使整个制剂从一个注射器转移到另一个并且然后再返回第一注射器的至少三个循环使制剂预乳化，其中每个循环持续至少6秒；和(iv)通过执行至少15个附加的转移循环使制剂乳化，其中每个循环持续至多2秒。在本文中，“ISA 51”表示目前市售的ISA 51VG，以及由其衍生的任何生物等效佐剂(例如，由从另一个来源分离的油酸或合成的油酸替换由橄榄分离的油酸)。还应该注意，在步骤(ii)中，水和油相的50/50比例可以变化。事实上，佐剂可以占整个溶液的至多60％。因此，除非另有规定，短语“使一体积的含水相与一体积的ISA 51混合”意味着“以包括50/50至40/60的W/O比例混合含水相和ISA 51”。重要的是，用于执行上述过程的注射器必须适合即其必须是无硅和无橡胶的(即柱塞不含任何橡胶头)，并且还优选不含胶乳。可用于执行本专利技术的注射器的实例是：-OR 2ml(编号:4606701V，来自B-Braun,德国),-OR 5ml(编号:4606710V，来自B-Braun,德国),-OR 2ml Norm-Ject(编号:4020.000V0，来自Henke Sass Wolf GMBH,德国),-OR 5ml Norm-Ject(编号:4050.000V0，来自Henke Sass Wolf GMBH,德国)。在根据本专利技术的方法中，通过用纯无菌水水合SEQ No:1的多肽冻干糕并等待直至溶解完成来执行步骤(i)。当该步骤在10至40℃的温度下执行时，几秒至2分钟是必要的，以获得冻干糕的完全溶解；如果需要，可以通过用两个手指拿取小瓶施加一至几秒的温和振荡。也可以在更低温度下例如在冰箱中(1-4℃)执行该溶解步骤。根据一个具体的实施方案，执行步骤(i)以获得0.5-6ml，优选约1ml或5ml体积的抗原水相。根据一个具体的实施方案，执行步骤(i)以使得SEQ No:1的肽在抗原水相中的最终浓度为2至20mg/ml，优选2至10mg/ml。在一个具体的实施方案中，通过使一体积的抗原水相装载至第一注射器并且使至少一体积的ISA 51装载至第二注射器，然后通过连接器桥接两个注射器来执行步骤(ii)，以使得最终的水相/ISA 51的比例被包含在50/50至40/60之间。从小瓶转移液体的最简单的方法是使用注射器和针头。但是，这种方法有刺破的风险。另一个更安全的解决方案是使用小瓶适配器，如来自West Pharmaceutical Services,Inc或Promepla(Monaco)的13mm或20mm的小瓶适配器。例如，可以按照如下描述的程序来执行步骤(ii)：·在通过泡罩包装处理小本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于获得油包水乳液的方法，所述油包水乳液用于向人受试者施用序列YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL(SEQ ID No:1)的多肽，所述方法包括以下步骤：(i)通过使冻干的SEQ No:1的多肽溶解于纯的无菌水中来获得抗原水相；(ii)将一体积的所述抗原水相和一体积的ISA 51装载至包括由连接器连接的两个注射器的装置中；(iii)通过执行使整个制剂从一个注射器转移到另一个并且然后再返回第一注射器的至少三个循环使制剂预乳化，其中每个循环持续至少6秒；和(ⅳ)通过执行至少20个附加的转移循环使制剂乳化，其中每个循环持续至多2秒。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.18 EP 13306769.41.一种用于获得油包水乳液的方法，所述油包水乳液用于向人受试者施用序列YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL(SEQ ID No:1)的多肽，所述方法包括以下步骤：(i)通过使冻干的SEQ No:1的多肽溶解于纯的无菌水中来获得抗原水相；(ii)将一体积的所述抗原水相和一体积的ISA 51装载至包括由连接器连接的两个注射器的装置中；(iii)通过执行使整个制剂从一个注射器转移到另一个并且然后再返回第一注射器的至少三个循环使制剂预乳化，其中每个循环持续至少6秒；和(ⅳ)通过执行至少20个附加的转移循环使制剂乳化，其中每个循环持续至多2秒。2.权利要求1所述的方法，其中通过用纯的无菌水在10至40℃的温度下水合SEQ No:1的多肽的冻干糕并等待直至溶解完成来执行步骤(i)。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中水溶液中的肽浓度为2至20mg/ml。4.前述权利要求任一项所述的方法，其中通过使一体积的抗原水相装载至第一注射器并且使一体积的ISA 51装载至第二注射器，然后通过连接器桥接两个注射器来执行步骤(ii)。5.前述权利要求中任一项所述的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：让娜·梅内雅梅，
申请(专利权)人：瓦克松生物技术公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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