用于癌症的个体化疫苗制造技术

本发明专利技术涉及用于癌症的个体化疫苗，本发明专利技术涉及提供对患者肿瘤特异并且可用于免疫治疗原发肿瘤及肿瘤转移的疫苗。在一个方面中，本发明专利技术涉及一种用于提供个体化癌症疫苗的方法，其包括以下步骤：(a)鉴定癌症患者肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变以提供所述患者的癌症突变标记(signature)；以及(b)提供以步骤(a)中获得的所述癌症突变标记为特征(featuring)的疫苗。在另一个方面中，本发明专利技术涉及可通过所述方法获得的疫苗。

【技术实现步骤摘要】
本申请是中国专利申请CN201280029551.X的分案申请，原申请是国际申请号PCT/EP2012/002209于2013年12月16日进入中国国家阶段的申请。
本专利技术涉及提供对患者肿瘤特异并且可用于免疫治疗原发肿瘤及肿瘤转移的疫苗。
技术介绍
癌症是死亡的主要原因，占所有死亡的四分之一。传统上，癌症治疗基于平均定律，即对最大数目患者而言作用最佳的癌症治疗。然而，由于癌症的分子异质性(heterogeneity)，常常只有低于25％的受治疗个体从经批准的疗法中获益。基于患者的定制治疗的个体化医疗被认为是解决药物开发革新中的低效和高成本的潜在方法。抗原特异性免疫治疗的目的在于加强或诱导患者中的特异性免疫应答并且已经成功用于控制癌症疾病。T细胞在人和动物的细胞介导免疫中发挥核心作用。在T细胞表面上表达的T细胞受体(TCR)介导特定抗原的识别和结合。T细胞的T细胞受体(TCR)能够与结合于主要组织相容性复合体(MHC)分子并且在靶细胞表面上呈递的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内的信号级联，导致增殖和分化成成熟的效应T细胞。越来越多的病原体相关抗原和肿瘤相关抗原(TAA)的鉴定产生了大批用于免疫治疗的合适靶标。可通过主动或被动免疫策略特异性靶向呈递源于这些抗原的免疫原性肽(表位)的细胞。主动免疫可倾向于诱导患者的抗原特异性T细胞并使其扩增，所述T细胞能够特异性识别和杀死病变细胞。可用于肿瘤疫苗接种的不同抗原形式包括全癌症细胞、蛋白质、肽或免疫载体如RNA、DNA或病毒载体，其可在体内直接施用或在体外通过脉冲(pulse)DC随后转移入患者。癌症可由基因组突变和表观遗传学变化的积累所引起，其中的一部分可能起致病性作用。除了肿瘤相关抗原之外，人癌症平均携带100～120个非同义突变，其中的许多可由疫苗靶向。肿瘤中超过95％的突变是独特的且患者特异的(Weide等2008:J.Immunother.31,180-188)。改变蛋白质的体细胞突变(可产生肿瘤特异性T细胞表位)的数目为30至400个。计算机预测每位患者有40至60个HLA I类限制性表位来源于肿瘤特异性体细胞突变(Azuma等1993:Nature 366,76-79)。另外，从头免(de novo)疫原性HLA II类限制性表位可能也是由肿瘤相关突变造成的，但是它们的数目仍未知。特别地，一些非同义突变以致病性的方式参与恶性转化，其对于维持致癌表型(驱动突变(driver mutation))是至关重要的，并且可代表癌症细胞的潜在“阿喀琉斯之踵(Achilles’heel)”。因为这种非同义突变不经受中枢免疫耐受，所以它们可以是个体癌症疫苗开发的理想候选物。在原发肿瘤中发现的突变也可存在于转移中。然而，若干研究表明患者的转移瘤需要个体肿瘤进展中的额外的基因突变，这些突变常常是临床相关的(Suzuki等2007:Mol.Oncol.1(2),172-180；Campbell等2010:Nature 467(7319),1109-1113)。另外，许多转移的分子特征也与原发肿瘤的显著不同。本专利技术的技术问题是提供高效的个体化癌症疫苗。本专利技术基于鉴定患者特异性癌症突变以及靶向患者的个体癌症突变“标记(signature)”。特别地，本专利技术涉及基于基因组测序、优选外显子组测序或转录组测序的个体化免疫治疗方法，其目的在于免疫治疗性靶向癌症中的多个个体突变。使用新一代测序(NGS)的测序使得能够快速和节约成本地鉴定患者特异性癌症突变。鉴定导致将由患者主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的氨基酸变化的非同义点突变提供了对患者癌症特异但在患者正常细胞中没有发现的新表位(novel epitope或neo-epitope)。收集一系列来自癌症细胞如循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)的突变使得能够提供诱导可靶向原发肿瘤(即使包含遗传上不同的亚类群)以及肿瘤转移之免疫应答的疫苗。对于疫苗接种，根据本申请鉴定的这种新表位以包含所述新表位的多肽的形式在患者中提供，在适当加工和被MHC分子呈递后，新表位被展示于患者的免疫系统用于刺激适当的T细胞。优选地，这种多肽通过施用编码该多肽的RNA而在患者中提供。在多种动物模型中成功测试了通过不同免疫途径将体外转录的RNA(IVT-RNA)直接注射至患者中的策略。RNA可在经转染细胞中被翻译并且加工后的表达蛋白质在细胞表面的MHC分子上呈递，以引发免疫应答。使用RNA作为一种可逆基因治疗的优点包括瞬时表达和非转化性特性。RNA不需要进入核以被表达，另外不会整合至宿主基因组中，从而消除了致癌的风险。用RNA可得到的转染率相当高。另外，所获得蛋白质的量相当于生理性表达中的量。用于免疫治疗性靶向多个个体突变的依据是(i)这些突变被专门地表达，(ii)可以预计对于T细胞免疫治疗而言突变表位是理想的，这是因为识别它们的T细胞不经历胸腺选择，(iii)可例如通过靶向对肿瘤表型高度相关的“驱动突变”来减少肿瘤免疫逃逸，和(iv)多表位免疫应答产生改进的临床益处的可能性更高。
技术实现思路
本专利技术涉及用于提供个体化重组癌症疫苗的有效方法，所述疫苗诱导癌症患者的有效和特异性免疫应答并且可靶向原发肿瘤及肿瘤转移。当向患者施用时，根据本专利技术提供的癌症疫苗提供了一批对患者肿瘤特异的适合用于刺激、启动(priming)和/或扩增T细胞的MHC呈递表位，所述T细胞针对表达所述MHC呈递表位所来源之抗原的细胞。因此，本文中描述的疫苗优选地能够诱导或促进细胞应答(优选细胞毒性T细胞活性)，所述细胞应答针对特征为用I类MHC呈递一种或更多种癌症表达抗原的癌症疾病。由于根据本专利技术提供的疫苗将靶向癌症特异性突变，所以其将对患者肿瘤特异。在一个方面中，本专利技术涉及一种用于提供个体化癌症疫苗的方法，其包括以下步骤：(a)鉴定癌症患者肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变，以提供所述患者的癌症突变标记(signature)；以及(b)提供以步骤(a)中获得的所述癌症突变标记为特征的疫苗。在一个实施方案中，本专利技术的方法包括以下步骤：i)提供来自癌症患者的肿瘤样本和优选地来源于所述癌症患者的非致瘤性(non-tumorigenous)样本；ii)鉴定所述肿瘤样本的基因组、外显子组和/或转录组与所述非致瘤性样本的基因组、外显子组和/或转录组之间的序列差异；iii)设计多肽，其包含整合步骤(ii)中确定的所述序列差异的表位；iv)提供步骤(iii)中设计的所述多肽或编码所述多肽的核酸(优选RNA)；以及v)提供包含步骤(iv)中提供的所述多肽或核酸的疫苗。根据本专利技术，肿瘤样本涉及来源于包含或预期包含肿瘤或癌症细胞之患者的任何样品，例如身体样品。所述身体样品可以是任何组织样品，例如血液、获自原发肿瘤或肿瘤转移的组织样品、或者包含肿瘤或癌症细胞的任何其他样品。优选地，身体样品为血液，并且在包含于血液中的一个或更多个循环肿瘤细胞(CTC)中确定癌症特异性体细胞突变或序列差异。在另一个实施方案中，肿瘤样本涉及一个或更多个分离的肿瘤或癌症细胞如循环肿瘤细胞(CTC)，或者包含一个或更多个分离的肿瘤或癌症细胞如循环肿瘤细胞(CT本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于提供个体化癌症疫苗的方法，其包括以下步骤：(a)鉴定癌症患者肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变，以提供所述患者的癌症突变标记；以及(b)提供以步骤(a)获得的所述癌症突变标记为特征的疫苗。

【技术特征摘要】
2011.05.24 EP PCT/EP2011/002576;2012.01.02 EP PCT/1.用于提供个体化癌症疫苗的方法，其包括以下步骤：(a)鉴定癌症患者肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变，以提供所述患者的癌症突变标记；以及(b)提供以步骤(a)获得的所述癌症突变标记为特征的疫苗。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述鉴定癌症特异性体细胞突变的步骤包括鉴定一个或更多个癌症细胞的外显子组的癌症突变标记。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述鉴定癌症特异性体细胞突变的步骤包括一个或更多个癌症细胞的单细胞测序。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述癌症细胞为循环肿瘤细胞。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述鉴定癌症特异性体细胞突变的步骤涉及使用新一代测序(NGS)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述鉴定癌症特异性体细胞突变的步骤包括对所述肿瘤样本的基因组DNA和/或RNA进行测序。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述鉴定癌症特异性体细胞突变的步骤至少以一式两份的方式重复。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其包括确定鉴定出的突变在用于癌症疫苗接种之表位中的可用性的另外步骤。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中以所述患者的突变标记为特征的所述疫苗包含多肽或编码所述多肽的核酸，所述多肽包含基于突变的新表位。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多肽包含多至30个基于突变的新表位。11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述多肽还包含由癌症细胞表达的不含癌症特异性体细胞突变的表位。12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述表位在其天然序列环境中以形成疫苗序列。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述疫苗序列的长度为约30个氨基酸。14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中所述新表位、表位和/或疫苗序列头尾连接地排列。15.根据权利要求9至14中任一项所述的方法，其中所述新表位、表位和/或疫苗序列通过接头分隔开。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述疫苗为RNA疫苗。17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述疫苗为预防性和/或治疗性疫苗。18.可通过根据权利要求1至17中任一项所述之方法获得的疫苗。19.包含重组多肽或编码所述多肽的核酸的疫苗，所述重组多肽包含基于突变的新表位，所述新表位因癌症患者肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变而产生。20.根据权利要求19所述的疫苗，其中所述多肽还包含由癌症细胞表达的不含癌症特异性体细胞突变的表位。21.治疗癌症患者的方法，其包括以下步骤：(a)通过根据权利要求1至17中任一项所述的方法提供个体化癌症疫苗；和(b)向所述患者施用所述疫苗。22.治疗癌症患者的方法，其包括向所述患者施用根据权利要求18至20中任一项所述的疫苗。23.用于基于新一代测序数据确定错误发现率的方法，所述方法包括：取得来自动物或人的遗传物质第一样品；取得来自动物或人的遗传物质第二样品；取得来自肿瘤细胞的遗传物质第一样品；取得来自所述肿瘤细胞的遗传物质第二样品；通过对既包含在所述肿瘤中又包含在所述来自动物或人的遗传物质第一样品和所述来自动物或人的遗传物质第二样品的至少之一中的参照基因组的全部碱基进行计数来确定共同覆盖肿瘤比较；通过对同时被所述来自动物或人的遗传物质第一样品和所述来自动物或人的遗传物质第二样品覆盖的参照基因组的全部碱基进行计数来确定共同覆盖相同-相同比较；用所述共同覆盖肿瘤比较除以所述共同覆盖相同-相同比较以形成归一化；通过以下来确定错误发现率：用1)在所述来自动物或人的遗传物质第一样品和所述来自动物或人的遗传物质第二样品的比较中品质评分大于Q的单核苷酸变异的数目除以2)在来自所述肿瘤细胞的所述遗传物质第一样品和来自所述肿瘤细胞的所述遗传物质第二样品的比较中品质评分大于Q的单核苷酸变异的数目，以及3)将结果乘以所述归一化。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述遗传物质为DNA。25.根据权利要求23所述的方法，其中通过以下来确定Q：建立一组品质特性S＝(s1、…、sn)，其中当对于所有i＝1、…、n，si>ti时，S优于T＝(t1、…、tn)，表示为S>T，；通过以下来确定中间错误发现率：用1)在所述来自动物或人的第一DNA样品和所述来自动物或人的第二DNA样品的比较中品质评分S>T的单核苷酸变异的数目除以2)在来自...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌尔·沙欣，塞巴斯蒂安·克赖特尔，穆斯塔法·迪肯，扬·狄克曼，米夏埃尔·科斯洛夫斯基，采德里克·布里滕，约翰·卡斯特勒，马丁·勒韦尔，贝恩哈德·雷纳，塔纳·欧莫科科，约翰内斯·亨德里克斯·德格拉夫，
申请(专利权)人：生物技术公司，约翰·古腾堡大学美因兹医学大学转化肿瘤学公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE