GH61多肽变体以及编码所述变体的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及GH61多肽变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】GH61多肽变体以及编码所述变体的多核苷酸[0001 ] 关于在联邦资助的研究和开发下完成的专利技术的权利的声明本专利技术是根据能源部授予的合作协议DE-FC36-08G018080在政府支持下完成的。政府在本专利技术中享有一定权利。对序列表的引用本申请含有一个计算机可读形式的序列表，该序列表通过引用结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及GH61多肽变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。相关技术的说明纤维素是单糖葡萄糖通过β -1, 4-键共价连接的一种聚合物。许多微生物产生水解连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置处消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶的攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端按序释放纤维二糖分子。纤维二糖是一种水溶性的β -1, 4-连接的葡萄糖二聚体。β -葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。 将木质纤维素原料转化成乙醇具有以下优点:大量原料的易得性、避免燃烧或填埋材料的合意性、以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物、以及城市固体废物已被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素、以及木质素组成。一旦将木质纤维素转化成可发酵的糖(例如葡萄糖)，那么这些可发酵的糖就可以容易地被酵母发酵成乙醇。W02005/074647, W02008/14813U 以及 W02011/035027 披露了来自土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。W02005/074656和W02010/065830披露了来自金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。W02007/089290 和 W02012/149344 披露了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。W02009/085935、W02009/085859、W02009/085864、以及 W02009/085868 披露了来自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。W02010/138754披露了来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。W02011/005867披露了来自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。W02011/039319披露了来自嗜热子囊菌属物种(Thermoascus sp)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。W02011/041397披露了来自青霉属物种(Penicillium sp.(埃默森(emersonii))的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。W02011/041504披露了来自甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。W02012/030799披露了来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。W02012/113340披露了来自嗜热棉毛菌(Thermomyces Ianuginosus)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。W02012/146171披露了来自特异腐质霉(Humicolainsolens)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。W02008/151043披露了通过向包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的组合物中添加可溶性活化二价金属阳离子来增加该多肽的活性的方法。W02012/044835和W02012/044836披露了具有纤维素分解增强活性以及改善的热活性和热稳定性的GH61多肽变体。本专利技术提供了具有增加的热稳定性的GH61多肽变体。专利技术概述本专利技术涉及分离的GH61多肽变体，其包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代，其中这些变体具有纤维素分 解增强活性。本专利技术还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。本专利技术还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，包括:在本专利技术的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物处理该纤维素材料。在一个方面，这些方法进一步包括回收降解的或转化的纤维素材料。本专利技术还涉及产生发酵产物的方法，包括:(a)在本专利技术的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物使纤维素材料糖化；(b)用一种或多种(例如若干种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；以及(C)从发酵物中回收该发酵产物。本专利技术还涉及发酵纤维素材料的方法，包括:用一种或多种(例如若干种)发酵微生物发酵该纤维素材料，其中该纤维素材料在本专利技术的GH61多肽变体的存在下用酶组合物糖化。在一个方面，该纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，这些方法进一步包括从发酵物中回收该发酵产物。附图简要说明图1示出编码具有纤维素分解增强活性的GH61B多肽的烟曲霉基因的基因组DNA序列(SEQ ID NO:29)和推断的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)。图2示出质粒pMMar44的限制性图谱。图3示出质粒pMMar49的限制性图谱。图4示出质粒pMMar45的限制性图谱。图5示出质粒pDFngll3的限制性图谱。图6示出添加烟曲霉GH61B多肽变体对高温纤维素组合物在50°C、55°C、以及60°C下进行的PCS转化的影响。图7示出质粒pDFngl53_4的限制性图谱。图8示出质粒pDFngl54_17的限制性图谱。图9示出质粒pDFngl55_33的限制性图谱。图10示出质粒pBGMH16的限制性图谱。定义乙酰木聚糖酯酶:术语“乙酰木聚糖酯酶”意指一种羧基酯酶(EC3.1.1.72)，它催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α -萘酯、以及乙酸对硝基苯酯的水解。出于本专利技术的目的，乙酰木聚糖酯酶活性是在含有0.01% TWEEN?20(聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯)的50mM乙酸钠(pH5.0)中使用0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物来测定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5、25°C下每分钟释放I微摩尔的对硝基苯酚阴离子的酶量。等位变体:术语“等位变体”意指基因的占据相同染色体基因座的两种或两种以上可替代形式中的任一者。等位变异通过突变天然地发生，并且可以导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽中没有变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶:术语“ a _L_阿拉伯呋喃糖苷酶”意指a _L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化a -L-阿拉伯糖苷中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种GH61多肽变体，包含一个在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.21 US 61/562,2771.一种GH61多肽变体，包含一个在与SEQ ID NO: 30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。2.如权利要求1所述的变体，该变体与亲本GH61多肽的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但少于100%的序列一致性。3.如权利要求1或2中任一项所述的变体，该变体是选自由以下各项组成的组的具有纤维素分解增强活性的亲本GH61多肽的变体:(a)与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或 180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或 216 的成熟多肽具有至少60%序列一致性的多肽；(b)由在至少低严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码的多肽:(i)SEQ ID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或 179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列，或(ii)⑴的全长互补体；(c)由与SEQ IDΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或 179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列具有至少60%的序列一致性的多核苷酸编码的多肽；以及(d)SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、I10、I12、I14、I16、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或 180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽的片段。4.如权利要求3所述的变体，其中该亲本GH61多肽包含SEQID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、...

【专利技术属性】
技术研发人员：J林，D伯翰，M马兰塔，L贝里斯福德，M拉姆萨，BG汉森，FW拉斯马森，M斯维尼，DJ博伊尔三世，
申请(专利权)人：诺维信股份有限公司，诺维信公司，
类型：发明
国别省市：美国;US