在丝状真菌宿主细胞中产生多种重组多肽的方法技术

本发明专利技术涉及构建用于产生具有生物活性的多种重组多肽的丝状真菌菌株的方法。本发明专利技术还涉及在丝状真菌菌株中产生具有生物活性的多种重组多肽的方法。本发明专利技术还涉及表达具有生物活性的多种重组多肽的丝状真菌菌株。

Method of Producing Multiple Recombinant Peptides in Host Cells of Filamentous Fungi

The present invention relates to a method for constructing filamentous fungal strains for producing various recombinant polypeptides with biological activity. The invention also relates to a method for producing a variety of recombinant polypeptides with biological activity in filamentous fungi strains. The invention also relates to filamentous fungal strains expressing various recombinant polypeptides with biological activity.

【技术实现步骤摘要】
在丝状真菌宿主细胞中产生多种重组多肽的方法本申请是2014年4月24日提交到中华人民共和国国家知识产权局的专利技术名称为“在丝状真菌宿主细胞中产生多种重组多肽的方法”、申请号为“201280052277.8”的专利技术专利申请的分案申请。序列表的引用本申请含有计算机可读形式的序列表，其通过引用的方式合并入本文。专利
本专利技术涉及在丝状真菌宿主细胞中产生多种重组多肽的方法。
技术介绍
在丝状真菌宿主细胞中重组产生多肽可以为生产商业相关量的多肽提供更为合意的载体。多肽的重组产生通常通过构建表达盒来实现，其中在表达盒中，将编码多肽的DNA置于来自调控基因的启动子的表达控制下。通常通过质粒介导的转化将表达盒导入到宿主细胞中。然后通过在表达盒中含有的启动子适当发挥作用所必需的诱导性条件下培养所转化的宿主细胞来实现多肽的生产。可以通过涉及原生质体形成、原生质体的转化和细胞壁的再生的方法以本身已知的方式用载体转化丝状真菌细胞。用两种或更多种载体单独或一起(共转化)转化丝状真菌宿主细胞的效率是非常低的，并受到可用的可选择性标记物的可得性的限制。本领域需要一些方法，通过将串联表达构建体定向至一个或多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建用于产生具有生物活性的多种重组多肽的丝状真菌菌株的方法，其包括：(a)通过向丝状真菌菌株中导入第一串联构建体，通过靶向整合取代内源性第一基因，所述第一串联构建体包含(i)所述第一基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii)一个或多个第一可选择性标记物，(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(v)所述第一基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；(b)通过向所述丝状真菌菌株中导入第二串联构建体，通过靶向整合取代内源性第二基因，所述第二串联构建体包...

【技术特征摘要】
2011.08.24 US 61/526,8091.一种构建用于产生具有生物活性的多种重组多肽的丝状真菌菌株的方法，其包括：(a)通过向丝状真菌菌株中导入第一串联构建体，通过靶向整合取代内源性第一基因，所述第一串联构建体包含(i)所述第一基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii)一个或多个第一可选择性标记物，(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(v)所述第一基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；(b)通过向所述丝状真菌菌株中导入第二串联构建体，通过靶向整合取代内源性第二基因，所述第二串联构建体包含(i)所述第二基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii)一个或多个第二可选择性标记物，(iii)与第三启动子和第三终止子可操作连接的编码具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸，(iv)与第四启动子和第四终止子可操作连接的编码具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸，和(v)所述第二基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；或(c)(a)和(b)的组合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一基因是编码选自以下的纤维二糖水解酶I的纤维二糖水解酶I基因：(i)包含SEQIDNO:2的成熟多肽的纤维二糖水解酶I，(ii)包含与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶I，(iii)由包含与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I，和(iv)由在至少高等严格条件例如非常高等严格条件下与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I；并且其中所述第二基因是编码选自以下的纤维二糖水解酶II的纤维二糖水解酶II基因：(i)包含SEQIDNO:4的成熟多肽的纤维二糖水解酶II，(ii)包含与SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶II，(iii)由包含与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II，和(iv)由在至少高等严格条件例如非常高等严格条件下与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中一个或多个串联构建体还包含一个或多个可选择性标记物的5’侧翼的第一同源重复和所述一个或多个可选择性标记物的3’侧翼的第二同源重复，其中所述第一同源重复和所述第二同源重复进行同源重组，以切除所述一个或多个可选择性标记物。4.一种丝状真菌菌株，其包含：(a)通过靶向整合用第一串联构建体取代的内源性第一基因，所述第一串联构建体包含(i)所述第一基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii)一个或多个可选择性标记物，(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(v)所述第一基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；(b)通过靶向整合用第二串联构建体取代的内源性第二基因，所述第二串联构建体包含(i)所述第二基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii)一个或多个可选择性标记物，(iii)与第三启动子和第三终止子可操作连接的编码具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸，(iv)与第四启动子和第四终止子可操作连接的编码具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸，和(v)所述第二基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；或(c)(a)和(b)的组合。5.根据权利要求4所述的丝状真菌菌株，其中所述第一基因是编码选自以下的纤维二糖水解酶I的纤维二糖水解酶I基因：(i)包含SEQIDNO:2的成熟多肽的纤维二糖水解酶I，(ii)包含与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶I，(iii)由包含与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I，和(iv)由在至少高等严格条件例如非常高等严格条件下与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I；并且其中所述第二基因是编码选自以下的纤维二糖水解酶II的纤维二糖水解酶II基因：(i)包含SEQIDNO:4的成熟多肽的纤维二糖水解酶II，(ii)包含与SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶II，(iii)由包含与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II，和(iv)由在至少高等严格条件例如非常高等严格条件下与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II。6.根据权利要求4或5所述的丝状真菌菌株，其中一个或多个串联构建体还包含所述一个或多个可选择性标记物的5’侧翼的第一同源重复和所述一个或多个可选择性标记物的3’侧翼的第二同源重复，其中所述第一同源重复和所述第二同源重复进行同源重组，以切除所述一个或多个可选择性标记物。7.一种在丝状真菌菌株中产生具有生物活性的多种重组多肽的方法，其包括：在有益于产生多肽的条件下培养丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞包含：(a)通过靶向整合用第一串联构建体取代的内源性第一基因，所述第一串联构建体包含(i)所述第一基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii)一个或多个可选择性标记物，(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(v)所述第一基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；(b)通过靶向整合用第二串联构建体取代的内源性第二基因，所述第二串联构建体包含(i)所述第二基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii)一个或多个可选择性标记物，(iii)与第三启动子和第三终止子可操作连接的编码具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸，(iv)与第四启动子和第四终止子可操作连接的编码具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸，和(v)所述第二基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；或(c)(a)和(b)的组合。8.根据权利要求7所述的方法，其还包括回收所述多种重组多肽。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述第一基因是编码选自以下的纤维二糖水解酶I的纤维二糖水解酶I基因：(i)包含SEQIDNO:2的成熟多肽的纤维二糖水解酶I，(ii)包含与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶I，(iii)由包含与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I，和(iv)由在至少高等严格条件例如非常高等严格条件下与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I；并且其中所述第二基因是编码选自以下的纤维二糖水解酶II的纤维二糖水解酶II基因：(i)包含SEQIDNO:4的成熟多肽的纤维二糖水解酶II，(ii)包含与SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶II，(iii)由包含与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II，和(iv)由在至少高等严格条件例如非常高等严格条件下与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II。10.根据权利要求7～9中任一项所述的方法，其中一个或多个串联构建体还包含所述一个或多个可选择性标记物的5’侧翼的第一同源重复和所述一个或多个可选择性标记物的3’侧翼的第二同源重复，其中所述第一同源重复和所述第二同源重复进行同源重组，以切除所述一个或多个可选择性标记物。11.一种串联构建体，其包含：(i)基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合；(ii)一个或多个第一可选择性标记物；(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸；(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸；和(v)所述基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合。12.根据权利要求11所述的串联构建体，其中所述基因是编码选自以下的纤维二糖水解酶I的纤维二糖水解酶I基因：(i)包含SEQIDNO:2的成熟多肽的纤维二糖水解酶I，(ii)包含与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶I，(iii)由包含与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I，和(iv)由在至少高等严格条件例如非常高等严格条件下与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I；或其中所述基因是编码选自以下的纤维二糖水解酶II的纤维二糖水解酶II基因：(i)包含SEQIDNO:4的成熟多肽的纤维二糖水解酶II，(ii)包含与SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶II，(iii)由包含与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II，和(iv)由在至少高等严格条件例如非常高等严格条件下与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交的多核苷酸所编码的纤维二...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·亚韦，金绮明，
申请(专利权)人：诺维信股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US