一种多肽纯化制备的方法技术

本发明专利技术涉及多肽纯化制备的方法。主要解决现有多肽纯化制备方法存在成本高、挥发性有机物排放、转盐困难等技术问题。本发明专利技术的技术方案是：对多肽进行分离纯化、浓缩、转盐、再浓缩的同时，将产生的高浓度乙腈废液，经过精馏回收，重新被系统利用，同步应用于多肽分离纯化的方法。此方法大大降低了多肽纯化制备的成本，并且减少了乙腈废液的排放。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多肽纯化制备方法，具体为一种利用反相高效液相色谱法结合乙腈的回收循环利用，对多肽进行纯化制备的方法。
技术介绍
随着现代生物技术的发展,出现了各种多肽类药物，多肽在临床医学中有巨大的应用价值。自从专利技术固相法化学合成多肽以来，有关各种活性多肽的化学合成有了很大发展，但产物成分比较复杂，一般是以目标多肽为主的几种结构相似的多肽混合物。因此，对这一混合物的分离纯化一直是一个重要的研究课题，对其分离纯化的最优化研究就显得格外重要。此外，提供高纯度的多肽样品，对于其物化性质、生物活性及其医药功能的研究具有重要的作用。从现代分离科学理论得出，色谱和电泳是目前所知的分离效果最佳的两种方法。电泳仅能用于分离而不能用于多肽的分离纯化。而高效液相色谱经过30多年的快速发展，在色谱理论研究、仪器研究水平、分析实践应用、质量研究、工业化大生产等方面，已经取得了长足的进步。其中反相高效液相色谱因其良好的选择性，具有分离效果好、分辨率高、回收率高的特点，在多肽的分离纯化中备受青睐，其应用范围不断扩大，具有广阔前景。利用反相高效液相色谱对多肽进行分离纯化时，反向色谱柱填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相，通常使用十八烷基硅烷键合硅胶。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常以水、缓冲液为水相，甲醇、乙腈、异丙醇等为有机相，水相和有机相组成混合试剂进行二元梯度洗脱。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。近年来，乙腈成为反相高效液相色谱常用的有机改性剂和溶剂，特别是在多肽分离纯化领域应用非常广泛。反相高效液相色谱对多肽进行分离纯化时，所使用的流动相（乙腈和水相）中，乙腈所占的比例为30%-70%（V/V），这样大量的乙腈使用后不加以回收利用，非常可惜，不仅会造成资源的浪费，还会污染环境。随着雾霾天频现，人们对大气污染越来越关注。挥发性有机物作为四大总体污染物之一，是形成霾和PM2.5的前提物，是造成环境污染、损害人体健康的主要“元凶”，因此，国家对挥发性有机物的治理势在必行。挥发性有机污染物早在上世纪八十年代，美国等发达国家就已经开始重视挥发性有机污染物的减排问题。2010年5月国务院发布《关于推进大气污染联防联控工作改善区域空气质量的指导意见》，首次将挥发性有机物与二氧化硫、氮氧化物、颗粒物等一起列为大气污染联防联控的重点污染物，提出加大挥发性有机物污染防治。“十二五”期间，挥发性有机物污染治理和防控政策则进入密集发布期，环保“十二五”规划提出要开展挥发性有机物和有毒废气监测，完善重点行业污染物排放标准。目前，挥发性有机物治理已进入我国大气污染治理日程。2015年上半年，环保部印发了《挥发性有机物排污收费试点办法》，2015年12月17日，上海市发布《上海市挥发性有机物排污收费试点实施办法》，决定试点收取挥发性有机物排污收费。试点分三个阶段实施，逐步提高收费标准。针对这种情况，许多企业为了减少有机物排污，将产生的挥发性有机物，如乙腈废液等，进行回收后，对其进行精制，然后重新供给生产企业使用。传统的乙腈回收有变压精馏法、恒沸精馏法、盐析方法、脱水剂脱水法，这几种方法均使用粗蒸及精馏两个步骤，使用特殊的精馏方法进行分离处理，存在处理方法复杂、设备成本高以及分离效率低，能耗高等问题。传统的转盐方法是利用玻璃柱或者聚乙烯柱里面装填阴阳离子树脂，利用离子交换的原理实现多肽产品的转盐过程。另外利用传统阴阳离子交换原理，对多肽产品进行转盐，步骤1）在调整多肽产品液体的PH后，上样挂柱2）冲洗样品3）利用酸碱调整冲洗液的PH后将多肽产品冲洗下来，在此过程中，每一个环节都要取少许的流出液进行HPLC检测，确认冲洗干净后，方可进行下一步工作。所以此方法，工作流程多，时间消耗大，而且会产生大量的废液，更重要的是最后收集的多肽产品合格液体积大，不利于下面的浓缩和冻干工作。另外需要购置仪器设备和阴阳离子填料，还需另外安排实验场地和人员，耗费了大量的人力物力。国内外不乏关于反相高效液相色谱应用的文献，也有许多关于乙腈回收、精制的文献资料，但是少有利用反相高效液相色谱法结合乙腈的回收循环利用，对多肽进行分离纯化的方法相关文献。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用反相高效液相色谱法结合乙腈的回收循环利用，对多肽进行纯化制备的方法，主要解决现有多肽纯化制备方法存在成本高、挥发性有机物排放、转盐困难等技术问题。其技术思路是利用反相高效液相色谱法对多肽进行纯化制备的同时，将产生的高浓度乙腈废液，经过回收，重新被系统利用，同步应用于多肽分离纯化的方法。此方法具有工艺简单、操作方便、成本低等优点。更有意义的是此方法大大降低了多肽纯化制备的成本，并且减少了乙腈废液的排放，既省钱又环保。应用此方法对多肽进行纯化制备，生产规模越大，节省下来的成本越可观。本专利技术的技术方案如下：一种多肽纯化制备的方法，包括以下步骤：1）多肽粗品溶解在醋酸、乙腈、水溶液中，超声处理，滤膜过滤，取滤液待用；2）利用反相高效液相色谱系统，对过滤后的多肽粗品进行分离纯化，制备动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度100%乙腈溶液，流动相B为质量百分浓度0.1%-0.3%醋酸水溶液，进行梯度洗脱分离纯化，采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰值的肽溶液；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程；3）将分离纯化后得到的高纯度目的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩液收集待用；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程；4）将浓缩液经过反相动态轴向压缩柱，采用离子交换法转成醋酸盐；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程；5）将转好醋酸盐合格产品进行减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程。步骤2）、3）、4）、5）所述的乙腈废液回收处理流程为：乙腈废液进入废液储罐，将废液储罐内的乙腈废液通过抽真空，转移至精馏塔的塔釜内，利用精馏塔，对乙腈废液进行精馏，收集高浓度的回收乙腈于储罐内，将检测合格的回收乙腈通过磁力泵经管道转移至合格回收乙腈储罐内，供反相高效液相色谱系统循环使用。步骤1）所述的多肽粗品其溶解条件体积比：醋酸∶乙腈∶水=1∶10∶40。步骤2）所述的制备动态轴向压缩柱内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶。步骤4）所述的反相动态轴向压缩柱转醋酸盐使用流动相为20～50mmol醋酸胺缓冲盐体系。所述的精馏塔，塔体里装填直径为4mm的玻璃弹簧填料。塔体外接加热循环器，内接再沸器，实现对乙腈废液内部循环加热及加热温度的自动调节和监控。所述的检测合格的回收乙腈，纯度大于99%，质量百分浓度大于85%。本专利技术的有益效果：本专利技术提出了一种利用反相高效液相色谱法结合乙腈的回收循环利用，对多肽进行纯化制备的方法。本专利技术乙腈回收具有下述特点：特点1：反相高效液相色谱系统对多肽进行纯化制备时产生的乙腈废液，经精馏塔精馏，将检测合格的回收乙腈通过磁力泵经四氟管道转移至有机相储罐内本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽纯化制备的方法，其特征是包括以下步骤：1）多肽粗品溶解在醋酸、乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤，取滤液待用；2）利用反相高效液相色谱系统，对过滤后的多肽粗品进行分离纯化，制备动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度100%乙腈溶液，流动相B为质量百分浓度0.1%‑0.3%醋酸水溶液，进行梯度洗脱分离纯化，采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰值的肽溶液；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程；3）将分离纯化后得到的高纯度目的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩液收集待用；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程；4）将浓缩液经过反相动态轴向压缩柱，采用离子交换法转成醋酸盐；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程；5）将转好醋酸盐合格产品进行减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程；步骤2）、3）、4）、5）所述乙腈废液回收处理流程：乙腈废液进入废液储罐，将废液储罐内的乙腈废液通过抽真空，转移至精馏塔的塔釜内，利用精馏塔，对乙腈废液进行精馏，收集高浓度的回收乙腈于储罐内，将检测合格的回收乙腈通过磁力泵经管道转移至合格回收乙腈储罐内，供反相高效液相色谱系统循环使用。...

【技术特征摘要】
1.一种多肽纯化制备的方法，其特征是包括以下步骤：
1）多肽粗品溶解在醋酸、乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤，取滤液待用；
2）利用反相高效液相色谱系统，对过滤后的多肽粗品进行分离纯化，制备动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度100%乙腈溶液，流动相B为质量百分浓度0.1%-0.3%醋酸水溶液，进行梯度洗脱分离纯化，采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰值的肽溶液；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程；
3）将分离纯化后得到的高纯度目的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩液收集待用；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程；
4）将浓缩液经过反相动态轴向压缩柱，采用离子交换法转成醋酸盐；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程；
5）将转好醋酸盐合格产品进行减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品；乙腈废液进入乙腈废液回收处理流程；
步骤2）、3）、4）、5）所述乙腈废液回收处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：张德志，赵晶，徐红岩，
申请(专利权)人：上海吉尔多肽有限公司，吉尔生化上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31