一种从咪唑类离子液体中分离多肽的方法技术

本发明专利技术为一种从咪唑类离子液体中分离多肽的方法，属于生物分子的纯化分离技术领域。所述的一种从咪唑类离子液体中分离多肽的方法采用盐析方法反萃取除去游离的咪唑类离子液体，然后采用含银离子的试剂将与多肽分子通过化学键结合的咪唑类离子彻底脱除。所述的从咪唑类离子液体中分离多肽的方法简单有效，成本低廉，能耗低，产品纯度高，大大提升了咪唑类离子液体在多肽化学中的适用性和应用范围。

【技术实现步骤摘要】
一种从咪唑类离子液体中分离多肽的方法所属
：本专利技术涉及生物分子的纯化分离
，尤其涉及一种从咪唑类离子液体中分离多肽的方法。
技术介绍
：由于多肽中可以包含不同组合和数量的亲水性和疏水性的氨基酸残基，并可折叠形成复杂的二级结构，造成其溶解性能的多样性和可变性。因此，在多肽化学中，溶剂的选择往往是一大挑战。目前，常用的无机和有机溶剂都无法兼容所有种类的多肽的溶解。室温离子液体，常简称为离子液体，是一类在室温下能保持液态的离子化合物。离子液体在材料、能源和化工领域应用广泛，是著名的绿色工业试剂。近年来，室温离子液体，特别是咪唑离子液体，开始作为新型溶剂在多肽化学领域获得应用。目前为止的研究中，咪唑离子液体对各种类型的多肽都表现出优异的溶解能力，兼具较佳的生物兼容性和卡宾前体催化属性，被广泛用于多肽片段连接反应[1]，氨基酸偶联反应[2]和多肽载体合成[3]。然而，正由于咪唑类离子液体对多肽强大的溶解能力，将溶于离子液体中的多肽分离出来也十分困难；有文献中通过乙醚循环萃取法[2]或者液相色谱法[4]从离子液体中分离多肽，但往往无法完全除去多肽样品中含有的离子液体。这主要是因为咪唑类离子液体的阴离子或阳离子对多肽分子中的氨基酸残基，如半胱氨酸、赖氨酸等，具有较强的化学结合能力和相互作用[4]。由于咪唑类离子液体在多肽上的结合易对多肽本身构象和生物膜离子通道等造成影响，可能造成多肽药物的变性或失活，对多肽在医药领域的应用造成障碍[4]。大多数情况下，多肽与离子液体分子之间存在化学键结合，含有极性残基，浓度往往在毫摩尔级别，也不适用离子交换树脂和抗溶剂结晶技术[5]方法。因此，这一现象大大制约了离子液体在多肽化学中的应用。针对这一问题，本专利技术提供了一种从咪唑类离子液体中分离多肽的方法，通过盐析效应的物理方法和含银离子脱除的化学方法，快捷方便地将离子液体彻底去除；同时，最大限度地使多肽的构型和活性不受影响。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提出一种从咪唑类离子液体中分离多肽的方法，以解决多肽难以从离子液体中分离纯化的问题。本实专利技术所采用的技术方案结合了物理反萃取分离和化学洗脱分离方法：步骤1，先以优选的多肽有机溶剂与含有咪唑类离子液体的多肽溶液按照一定比例混合；步骤2，滴加优选的反萃剂至溶液出现分相，形成溶剂层与反萃剂层，分离溶剂相与反萃剂相；步骤3，对分离所得的溶剂相重复步骤2三次或三次以上；步骤4，向多次分离纯化后的溶剂相中，添加含银离子的离子液体脱除剂，反应放出热量，快速生成杂环卡宾银络合物[6]或不溶性银盐的白色絮状沉淀，离心过滤除去沉淀；步骤5，所得溶液纯化后，冻干除去溶剂，得到不含离子液体的多肽纯品。所述的技术方案中，多肽有机溶剂可以是异丙醇、异丁醇、丙二醇、丁二醇、乙腈、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷；其中，溶剂优选的标准为：对分离的目标多肽具有的溶解能力高于对所用的离子液体具有的溶解能力。所述的技术方案中，咪唑类离子液体可以是含有咪唑类阳离子或咪唑类阴离子的离子液体。所述含有咪唑阳离子的离子液体结构式可以是：所述含有咪唑阴离子的离子液体结构式可以是：其中，结构式中的R1、R2、R3、R4、R5可以是氢、烃基、含卤基、含氧官能团、含氮官能团、含磷官能团、含硫官能团；X-可以是无机酸或者有机酸的酸根阴离子；Y+可以是胆碱类、胺类、单核咪唑类、双核咪唑类阳离子。所述的技术方案中，多肽可以是含有通过肽键连接自然或非自然氨基酸残基的生物分子。所述的技术方案中，反萃剂可以是水(包含缓冲水溶液)、甲醇、乙醇或正丙醇；优选的标准为：对离子液体具有的溶解能力高于对分离的目标多肽具有的溶解能力，并可以在一定混合比例下使溶液体系发生盐析效应，形成液液分相。所述的技术方案中，含银离子的离子液体脱除剂是含银离子的均匀分散体系或能通过物理化学手段产生银离子的均匀分散体系，可以但不限于是银盐的溶液、银盐的悬浊液、氧化银的溶液、氧化银的悬浊液或它们的混合物；优选的标准为：不影响多肽稳定性，与离子液体反应迅速完全，并生成易于分离的沉淀。本专利技术提供的从咪唑类离子液体中分离多肽的方法，和现有技术相比，具有如下创新与优势：1.本专利技术提供的从咪唑类离子液体中分离多肽的方法，利用离子液体在混溶共沸物中的盐析效应，可简便地去除大部分游离态的离子液体，避免多肽产品在分离过程中的流失；2.本专利技术提供的从咪唑类离子液体中分离多肽的方法，利用咪唑类离子液体的化学特性，通过添加银离子脱除剂的方式，将以化学键结合在多肽残基上的咪唑离子快速脱除，分离成本低廉；3.本专利技术提供的从咪唑类离子液体中分离多肽的方法兼容于含有不同种类残基的多肽，可同时去除咪唑阳离子和咪唑阴离子，多肽本身活性并不受到影响。附图说明：图1是在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中多肽LYRAGCRANK的高效液相色谱图。图2是从离子液体1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中分离出多肽LYRAGCRANK的高效液相色谱图。图3是从离子液体1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐分离出多肽LYRAGCRANK的ESI质谱图。图4是在离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐中亮氨酸脑啡肽的高效液相色谱图。图5是从离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐中分离出亮氨酸脑啡肽的高效液相色谱图。图6是从离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐中分离出的亮氨酸脑啡肽的ESI质谱图。图7是在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中μ-芋螺毒素SIIIA高效液相色谱图。图8是从在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中分离出μ-芋螺毒素SIIIA的高效液相色谱图。图9是从在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中分离出μ-芋螺毒素SIIIA的ESI质谱图。图10是在离子液体胆碱咪唑盐中μ-芋螺毒素SIIIA的高效液相色谱图。图11是从离子液体胆碱咪唑盐中分离出μ-芋螺毒素SIIIA的高效液相色谱图。图12是从离子液体胆碱咪唑盐中分离出μ-芋螺毒素SIIIA的ESI质谱图具体实施方式：下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的实验材料、试剂等均可通过商业途径或已知实验方法获得。实施例1文献[1]中，多肽LYRAGCRANK曾以离子液体1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐为溶剂被合成。在本实施例中，应用本专利技术提供的方法进行多肽LYRAGCRANK在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中的分离。实验装置主要是50毫升带刻度尖底试管、过滤器、移液管、离心机、水浴装置、震荡搅拌器和低温真空干燥装置。步骤1，将多肽LYRAGCRANK溶解在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中，形成1mL浓度为3nmol/L的多肽离子液体溶液。步骤2，加入10mL的丙二醇，震荡搅拌。步骤3，添加200μL纯水，产生雾状现象，将所得混合液以最高速离心分离30分钟使分层。步骤4，小心移除试管底部的含离子液体的水层。步骤5，对所得的溶液重复步骤3和4，直至滴加纯水时不再出现雾状现象。步骤6，在水浴的条件下，缓慢滴加含20％硝酸银的丙二醇溶液；至白色沉淀不再继续产生时立即停止滴加；步骤6的反应式为：步骤7，离心分离20分钟，并用石英纤维滤纸过滤除去沉淀；步骤8，将所得溶液通过采本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从咪唑类离子液体中分离多肽的方法，其特征在于，结合了物理反萃取分离和化学洗脱分离方法，包括如下步骤：(1)先以多肽有机溶剂与含有咪唑类离子液体的多肽溶液按照一定比例混合；(2)利用盐析效应的原理，添加反萃取剂，对多肽溶液中的咪唑类离子液体进行反萃取；(3)在分离所得的多肽溶液中添加含银离子的离子液体脱除剂；(4)过滤除去生成的沉淀；(5)所得溶液纯化冻干后，得到多肽产品。

【技术特征摘要】
1.一种从咪唑类离子液体中分离多肽的方法，其特征在于，结合了物理反萃取分离和化学洗脱分离方法，包括如下步骤：(1)先以多肽有机溶剂与含有咪唑类离子液体的多肽溶液按照一定比例混合，其中所用的多肽有机溶剂对分离的目标多肽具有的溶解能力应高于对所用的咪唑类离子液体具有的溶解能力；(2)利用盐析效应的原理，添加反萃取剂，对多肽溶液中的咪唑类离子液体进行反萃取，采用的多肽有机溶剂与反萃取剂的组合分别有：...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈铭，
申请(专利权)人：陈铭，
类型：发明
国别省市：上海;31