诱导间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)转分化为皮肤干细胞(AD-SSCs)的方法，具体包括如下步骤：S1，快速分离和纯化均质的脂肪间充质干细胞；S2，选择多种可用于干细胞表观遗传调控的小RNA分子；S3，组装和转染核酸多肽纳米粒；S4，制备诱导间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的培养基；S5，激活多种指导皮肤干细胞自我更新和转分化的相关基因。本发明专利技术使用容易获取、来源充足、无道德伦理问题和安全有效的人体脂肪间充质干细胞作为诱导对象，通过转染2个小RNAs分子，在一种特制的无血清培养基的作用下大规模并快速高纯度地转分化成AD-SSCs。这些诱导的皮肤干细胞与人体中天然产生的皮肤干细胞一样，具有自我更新能力和分化为皮肤细胞的潜能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞培养转化
，尤其涉及一种诱导间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的方法。
技术介绍
脂肪间充质干细胞(Adipose-derivedstemcell，AD-MSCs)的主要来源白色脂肪(whiteadiposetissue，WAT)在体内分布广泛，储量丰富，是一种成体间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)，这类间充质干细胞广泛分布于不同的组织，如骨髓、骨骼肌、脂肪、心肌及肝脏等不同部位。研究发现MSCs具有如下特征：(1)脂肪组织中数量巨大，50ml脂肪组织可以产生大约5×105间充质干细胞，大约是骨髓中获取干细胞数量的500倍；(2)取材安全简便，在局麻下即可获取大量细胞，体外扩增和自我更新能力很强；(3)可以向多种细胞系分化：脂肪、骨、软骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、内皮、肝细胞、造血细胞以及神经元细胞，AD-MSCs是真正意义上的具有多向分化潜能的干细胞；(4)可以分泌多种细胞因子，参与皮肤组织的修补、更新和重塑；(5)脂肪组织中AD-MSCs数量不随供者年龄增加而减少。AD-MSCs体外扩增和自我更新能力强，原代培养约5-7天后，细胞融合超过90％，能较稳定传代20代以上。AD-MSCs具有间充质干细胞的特异性表面标记，表达大量的粘附分子：AD-MSCs持续性表达CD9、整合素β1(CD29)和α4(CD49d)、细胞间粘附分子1(ICAM-1，即CD54)、CD105、血管细胞粘附分子(VCAM，即CD106)和活化淋巴细胞粘附分子(ALCAM，即CD166)，表达I类组织相容性蛋白HLA-ABC。AD-MSCs不表达造血细胞表面标志CD14、CD15、CD33，CD34或CD45，不表达II类组织相容性抗原HLA-DR及内皮细胞标志CD31，不表达共刺激因子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和CD40。脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)具有定向分化为组织修复所需要的终末分化细胞的能力，为组织修复以及构建组织工程皮肤提供充足的细胞来源。在体外将AD-MSCs定向诱导分化为表皮细胞的方法较多：研究表明用皮肤匀浆液处理AD-MSCs，单独培养或与热休克损伤的HeCat细胞共培养，诱导AD-MSCs向表皮细胞定向分化表达CK10、CK14、CK19，其诱导分化效率高于单纯使用表皮生长因子EGF。一些试验结果指出利用EGF以及维甲酸等成分诱导AD-MSCs分化，10天后细胞出现铺路石改变，细胞表达CK19，向上皮细胞分化，表达上皮细胞早期的表面标记-角蛋白CK18，不再表达波形蛋白等间充质干细胞标志。另组研究人员将AD-MSCs在角质细胞条件培养基中培养3周，发现AD-MSCs向角质形成细胞分化，表达CK5和CK14。但是总的来说，这些方法诱导转化为皮肤细胞的效率较低、所需时间教长，细胞均一性较差。尤其是怎样诱导高效转分化为皮肤干细胞的关键问题没有解决。AD-MSCs除了可分化为多种细胞外，还可以分泌多种细胞因子如VEGF，粒系/巨噬细胞系集落刺激因子M-CSF，基质来源因子SDF-1α，HGF，IGF-1，KGF以及bFGF。动物创伤模型显示，ADSCs-CM中的TGF-β1[29]通过增加透明质酸酶HAS-1以及HAS-2表达，促进透明质酸合成；ADSCs-CM还可以上调细胞外基质I、III型胶原、纤连蛋白的mRNA水平，下调MMP-9的mRNA水平，增强HDF分泌I型胶原，刺激胶原合成和成纤维细胞迁移，在体内促进伤口愈合。局部注射AD-MSCs到糖尿病缺血模型创面，提高血浆和组织中VEGF的含量，明显缩小创面面积，局部新生血管增加，加快愈合速度，改善创面愈合后质量。总之，AD-MSCs能够改善皮肤组织的微环境，促进皮肤组织细胞的代谢和更新，调节细胞外基质沉积以及重塑，修复皮肤的损伤和防止皮肤的衰老。AD-MSCs在实验室中经过长期传代或冻存仍然保持干细胞特征，增殖分化能力和相应的免疫原性，无明显的免疫学特性改变，但多代增殖后有衰老和变形的倾向。向免疫缺陷小鼠静脉内注射大量的AD-MSCs小鼠存活且无副作用，也无肿瘤发生。在人体临床试验，单次注射1-4×109细胞，随访36个月无任何副作用发生，不会诱导肿瘤发生。综上所述，AD-MSCs具有多向分化潜能，促进新生血管形成，加速创面愈合。治疗所用的AD-MSCs可来自患者自身的脂肪，因此，有望在不引起任何免疫排斥的情况下修复受损组织和更新和激活衰老的皮肤细胞。由于AD-MSCs来源充足，易于分离，安全无致瘤性，是用于自体干细胞移植防治皮肤疾患和衰老的最佳细胞来源。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种诱导人体脂肪间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的方法，本专利技术的方法解决了现有诱导干细胞转分化技术中转化率不高、需要时间长和转化后皮肤干细胞数量少和纯度低等问题。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种诱导间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的方法，其包括如下步骤：S1，快速分离和纯化均质的脂肪间充质干细胞；S2，选择多种可用于干细胞表观遗传调控的小RNA分子；S3，组装和转染核酸多肽纳米粒；S4，制备诱导间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的培养基；S5，激活多种指导皮肤干细胞自我更新和转分化的相关基因。作为优选的技术方案，步骤S1快速分离，纯化均一和无分化长期扩增脂肪间充质干细胞的方法还包括以下步骤：S11，无菌条件下，将机器抽取的细小颗粒人体脂肪组织用PBS液漂洗3次，祛除残余的血液和组织碎片；S12，将30-60ml碎小的脂肪组织以1∶1比例与0.25％I型胶原酶溶液混合，置于ClinicMACSProtégé组织分离细胞纯化机的工作管中，将工作温度调到37℃，分离细胞纯化机的旋转速度设置为60转/分，正反转各转15分钟；S13，分离完毕，加入10％FBS低糖DMEM终止消化，接着进行1500转/分的离心处理，处理时间为10分钟，取沉淀的细胞颗粒，用PBS清洗2遍；S14，用含5-10％FBS，5ng/mlFGF-b，5ng/mlPDGF-BB，5ng/mlIGF-1，3ng/mlHGF，3ng/mlEGF，3ng/mlVEGF，5ng/mlIL-8，0.5ng/mlTGF-beta，1ng/mlLIF，100uMVc，100U青霉素和100mg/L链霉素的低糖DMEM/F12重悬；S15，以差速帖壁方法除去残留的成纤维细胞，用地塞米松去除残留的单核血细胞。作为优选的技术方案，所述的步骤S2中多种可用于干细胞表观遗传调控的小RNA分子是指antisense-24(anti-24)和antisense-29(anti-29)分子的序列，它们的靶分子分别是人miR-24和miR-29，它们可调节多种与皮肤干细胞和其分化的下游功能细胞有关的基因，尤其是AKT和TCF3/4等。并以干粉重量的0.6∶0.4比例要求进行混合配制。所述的步骤S3组装和转染核酸多肽纳米粒是指不同的小RNA分子与多肽转染试剂按一定配比、程序和时间的配制过程(参见具体实施方式部分的四)，通过每天一次共二次的转染(第一次为消化后转染，第二次为非消化转染)和至少4天的培养以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，快速分离和纯化均质的脂肪间充质干细胞；S2，选择多种可用于干细胞表观遗传调控的小RNA分子；S3，组装和转染核酸多肽纳米粒；S4，制备诱导间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的培养基；S5，激活多种指导皮肤干细胞自我更新和转分化的相关基因。

【技术特征摘要】
1.一种诱导间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，快速分离和纯化均质的脂肪间充质干细胞；S2，选择多种可用于干细胞表观遗传调控的小RNA分子；S3，组装和转染核酸多肽纳米粒；S4，制备诱导间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的培养基；S5，激活多种指导皮肤干细胞自我更新和转分化的相关基因。2.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤S1包括如下步骤：S11，用PBS液漂洗脂肪颗粒祛除残余的血液和组织碎片；S12，将碎小的脂肪组织以1∶1比例与0.25％I型胶原酶溶液混合，置于ClinicMACSProtégé组织分离细胞纯化机的工作管中，将工作温度调到37℃，分离细胞纯化机的旋转速度设置为60转/分，正反转各转15分钟；S13，分离完毕，加入10％FBS低糖DMEM终止消化，接着进行1500转/分的离心处理，处理时间为10分钟，取沉淀的细胞颗粒，用PBS清洗；S14，用含5-10％FBS，5ng/mlFGF-b，5ng/mlPDGF-BB，5ng/mlIGF-1，3ng/mlHGF，3ng/mlEGF，3ng/mlVEGF，5ng/mlIL-8，0.5ng/mlTGF-beta，1ng/mlLIF，100uMVc，100U青霉素和100mg/L链霉素的低糖DMEM/F12重悬；S15，以差速帖壁方法除去残留的成纤维细胞，用地塞米松去除残留的单核血细胞。3.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞转分化为皮肤干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤S2中多种可用于干细胞表观遗传调控的小RNA分子是指miR-24和miR-29的反义核酸Anti-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄兵，殷勤伟，
申请(专利权)人：黄兵，殷勤伟，
类型：发明
国别省市：北京;11