高效CIK细胞制备及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种高效CIK细胞制备及检测方法，为解决现有技术增殖倍数低，制备工艺不稳定等问题，包括如下步骤：根据淋巴细胞绝对值无菌采集健康人或患者外周血；全血检验与血样保存；血浆的分离与灭活；采用密度梯度离心法，即用淋巴细胞分离液Ficoll分离出单个核细胞；在CIK细胞诱导过程中，先后加入因子1和因子2，细胞经过约2‑3周的无血清诱导扩增培养即可进行收获，制成CIK细胞制剂。该方法具有采血量少、制备工艺稳定、操作简便、高细胞增殖倍数和细胞毒活性的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种CIK细胞制备方法，特别是涉及一种高效CIK细胞制备及检测方法。专利技术背景过继性免疫治疗已经成为继手术、放疗和化疗等三大传统治疗方法后的第四种治疗方法，特别是细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKillercells，CIK)，因其具有增殖速度快、杀瘤谱广、杀瘤活性高、对正常骨髓造血前体细胞毒性小、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、可与传统治疗手段相结合等特点而得到广泛认可，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合临床应用的一种理想的效应细胞。CIK细胞在正常外周血中极其少见，仅为1％～5％。CIK细胞制备技术的发现使其应用于临床成为可能。CIK细胞最早由美国科学家于20世纪九十年代首次报道，他们发现通过多种细胞因子(IFN-γ、CD3单克隆抗体、IL-2和IL-1)的共同刺激，外周血单个核细胞可以被诱导出大量具有肿瘤杀伤活性的细胞。因该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，所以其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性又具有自然杀伤细胞的非MHC限制性的双重特性。该制备方法作为传统的CIK细胞制备方法沿用至今，但获得的CIK细胞在细胞毒活性和增殖倍数等方面并不是很理想。随着科技的进步，无血清培养技术的应用以及新的细胞生长刺激物的发现等为CIK细胞制备方法提供了改进空间。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种高效CIK细胞制备方法，本专利技术的目的还在于提供该方法制备的CIK细胞检测方法。本专利技术的目的旨在针对传统方法所得CIK细胞存在增殖倍数低、CD3+CD56+双阳表达率不高、制备工艺不稳定等问题，对传统的CIK细胞制备方法进行了改进。为实现上述目的，本专利技术高效CIK细胞制备方法包括如下步骤：(1)全血检验与血样保存：用移液管将原血从采血管中转移至离心管中，反复吹打混匀后：取出血样用于微生物检测、取血样于冻存管中冷藏保存，作为档案以备后续检验；(2)血浆处理：将盛有原血的离心管放入离心机中，配平后离心，将上层血浆转移到离心管中，盖紧盖子，贴封口膜，置于56℃水浴锅中灭活，灭活后离心弃沉淀，留上清保存待用；(3)分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀得稀释血样；用移液管把稀释血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，旋紧盖子离心；稀释血样要加到FicoLL的上层，切勿打破分界面；将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将生理盐水血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀得单核细胞稀释液；(4)单核细胞洗涤：将上步收集好的单核细胞稀释液进行离心弃上清液；再重复加生理盐水混合均匀离心弃上清液多次，最后收集得到的沉淀即为单核细胞；(5)单核细胞培养。具有避免了外源潜在的病源微生物的感染，制备工艺稳定，操作简单；明显提高CIK细胞增殖倍数和细胞毒活性的优点。作为优化，单核细胞培养是：Day0+因子1：用无血清培养基重悬(4)步单核细胞，加入IFN-γ因子1得细胞悬液，将细胞悬液转移到培养瓶中，旋紧透气瓶盖，置于37℃，5％CO2的培养箱中进行细胞培养；Day1+因子2：培养后，加入含CD3McAb、CD28McAb、IL-2及IL-1α的因子2置于培养箱中进行细胞培养；并根据需要扩增培养，以后扩增细胞加入培养基时，在新鲜的培养基中加入IL-2的量要加倍；Day3+50：上步细胞培养三天后，在显微镜下观察到：细胞体积明显增大，形状多呈增殖分裂状，细胞集落出现、细胞数量增多、培养基颜色变为黄色时，加入新鲜的已加入IL-2的无血清培养基以满足细胞生长的需要；Day5+100：随着细胞进入快速增殖期，生长迅速，需要每日显微镜下对细胞进行观察，观察指标同上步Day3，并补加新鲜已加入IL-2的无血清培养基；Day7BC(BagCuLtivation)：显微镜下观察细胞状态，观察指标同上步Day5；在生物安全柜中用移液管反复吹打混匀细胞，取出细胞悬液样于离心管中，用赤藓红染色计算细胞密度，当细胞密度达到要求时，通过注射器连接细胞培养袋，将细胞培养瓶中的细胞悬液转入细胞培养袋中，用新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分多次洗涤培养瓶，将洗涤培养基合并至细胞培养袋中；Day10+600：间隔四天后，培养基颜色明显变黄，细胞数量明显增多，补加新鲜培养基，操作同上步day7BC；Day12MT(MicrobioLogicaLTests)：细胞收获前两天，对培养体系做微生物检测；Day14H(Harvest)：1)从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中离心弃上清液，用涡旋振荡器振散细胞团块；2)用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次，多次洗得细胞悬液并入另一离心管中，依此操作将离心管合并为至少两个，离心弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；3)用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次，多次洗得细胞悬液并入另一离心管中，吸取细胞样本于离心管中进行细胞计数，向合并多次洗得细胞悬液中加入生理盐水离心弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；4)加入生理盐水并混匀，加入人血白蛋白混匀得细胞悬液；取出细胞悬液样品进行内毒素及微生物检测，并留样冻于冰箱待后续检测，细胞悬液过细胞筛后转入细胞转移袋中封口，待检测合格即为制成。作为优化，Day0+因子1步：细胞接种浓度为1-3×106/mL，IFN-γ工作浓度为500-1000U/mL；Day1+因子2步：CD3McAb工作浓度为50-100ng/mL、CD28McAb工作浓度为50-100ng/mL、IL-2工作浓度为500-1000U/mL，IL-1α工作浓度为500-1000U/mL；以后扩增细胞加入培养基时，要在新鲜的培养基中按1000-2000U/mL加入IL-2；Day7BC(BagCuLtivation)步；细胞密度达到的要求为细胞密度达到1.0×106；Day14H(Harvest)步；4)加入适量人血白蛋白的终浓度为1％)。作为优化，Day0+因子1步；重悬细胞的无血清培养基是50mL，培养瓶为T175培养瓶；Day1+因子2步；培养后是培养24h后；Day3+50步：加入新鲜的已加入IL-2的无血清培养基后，体积定量为50mL；Day5+100步：补加新鲜已加入IL-2的无血清培养基，体积定量为100mL；Day7BC(BagCuLtivation)步：反复吹打用的移液管为10mL移液管，取出细胞悬液样于离心管中是取出约0.5mL细胞悬液于1.5mL离心管中，连接细胞培养袋的注射器是60mL注射器，细胞培养瓶是T175细胞培养瓶，用新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分多次洗涤培养瓶是用400mL新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分2次洗涤T175培养瓶；Day10+600步：补加新鲜培养基是补加600mL新鲜培养基；Day12MT(MicrobioLogicaLTests)步：对培养体系做微生物检测是将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效CIK细胞制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)全血检验与血样保存：用移液管将原血从采血管中转移至离心管中，反复吹打混匀后：取出血样用于微生物检测、取血样于冻存管中冷藏保存，作为档案以备后续检验；(2)血浆处理：将盛有原血的离心管放入离心机中，配平后离心，将上层血浆转移到离心管中，盖紧盖子，贴封口膜，置于56℃水浴锅中灭活，灭活后离心弃沉淀，留上清保存待用；(3)分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀得稀释血样；用移液管把稀释血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，旋紧盖子离心；稀释血样要加到FicoLL的上层，切勿打破分界面；将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将生理盐水血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀得单核细胞稀释液；(4)单核细胞洗涤：将上步收集好的单核细胞稀释液进行离心弃上清液；再重复加生理盐水混合均匀离心弃上清液多次，最后收集得到的沉淀即为单核细胞；(5)单核细胞培养。...

【技术特征摘要】
1.一种高效CIK细胞制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)全血检验与血样保存：用移液管将原血从采血管中转移至离心管中，反复吹打混匀后：取出血样用于微生物检测、取血样于冻存管中冷藏保存，作为档案以备后续检验；(2)血浆处理：将盛有原血的离心管放入离心机中，配平后离心，将上层血浆转移到离心管中，盖紧盖子，贴封口膜，置于56℃水浴锅中灭活，灭活后离心弃沉淀，留上清保存待用；(3)分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀得稀释血样；用移液管把稀释血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，旋紧盖子离心；稀释血样要加到FicoLL的上层，切勿打破分界面；将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将生理盐水血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀得单核细胞稀释液；(4)单核细胞洗涤：将上步收集好的单核细胞稀释液进行离心弃上清液；再重复加生理盐水混合均匀离心弃上清液多次，最后收集得到的沉淀即为单核细胞；(5)单核细胞培养。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于单核细胞培养是：Day0+因子1：用无血清培养基重悬(4)步单核细胞，加入IFN-γ因子1得细胞悬液，将细胞悬液转移到培养瓶中，旋紧透气瓶盖，置于37℃，5％CO2的培养箱中进行细胞培养；Day1+因子2：培养后，加入含CD3McAb、CD28McAb、IL-2及IL-1α的因子2置于培养箱中进行细胞培养；并根据需要扩增培养，以后扩增细胞加入培养基时，在新鲜的培养基中加入IL-2的量要加倍；Day3+50：上步细胞培养三天后，在显微镜下观察到：细胞体积明显增大，形状多呈增殖分裂状，细胞集落出现、细胞数量增多、培养基颜色变为黄色时，加入新鲜的已加入IL-2的无血清培养基以满足细胞生长的需要；Day5+100：随着细胞进入快速增殖期，生长迅速，需要每日显微镜下对细胞进行观察，观察指标同上步Day3，并补加新鲜已加入IL-2的无血清培养基；Day7BC：显微镜下观察细胞状态，观察指标同上步Day5；在生物安全柜中用移液管反复吹打混匀细胞，取出细胞悬液样于离心管中，用赤藓红染色计算细胞密度，当细胞密度达到要求时，通过注射器连接细胞培养袋，将细胞培养瓶中的细胞悬液转入细胞培养袋中，用新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分多次洗涤培养瓶，将洗涤培养基合并至细胞培养袋中；Day10+600：间隔四天后，培养基颜色明显变黄，细胞数量明显增多，补加新鲜培养基，操作同上步day7BC；Day12MT：细胞收获前两天，对培养体系做微生物检测；Day14H：1)从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中离心弃上清液，用涡旋振荡器振散细胞团块；2)用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次，多次洗得细胞悬液并入另一离心管中，依此操作将离心管合并为至少两个，离心弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；3)用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次，多次洗得细胞悬液并入另一离心管中，吸取细胞样本于离心管中进行细胞计数，向合并多次洗得细胞悬液中加入生理盐水离心弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；4)加入生理盐水并混匀，加入人血白蛋白混匀得细胞悬液；取出细胞悬液样品进行内毒素及微生物检测，并留样冻于冰箱待后续检测，细胞悬液过细胞筛后转入细胞转移袋中封口，待检测合格即为制成。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于Day0+因子1步：细胞接种浓度为1-3×106/mL，IFN-γ工作浓度为500-1000U/mL；Day1+因子2步：CD3McAb工作浓度为50-100ng/mL、CD28McAb工作浓度为50-100ng/mL、IL-2工作浓度为500-1000U/mL，IL-1α工作浓度为500-1000U/mL；以后扩增细胞加入培养基时，要在新鲜的培养基中按1000-2000U/mL加入IL-2；Day7BC步：细胞密度达到的要求为细胞密度达到1.0×106；Day14H步：4)加入适量人血白蛋白的终浓度为1％)。4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于Day0+因子1步：重悬细胞的无血清培养基是50mL，培养瓶为T175培养瓶；Day1+因子2步：培养后是培养24h后；Day3+50步：加入新鲜的已加入IL-2的无血清培养基后，体积定量为50mL；Day5+100步：补加新鲜已加入IL-2的无血清培养基，体积定量为100mL；Day7BC步：反复吹打用的移液管为10mL移液管，取出细胞悬液样于离心管中是取出约0.5mL细胞悬液于1.5mL离心管中，连接细胞培养袋的注射器是60mL注射器，细胞培养瓶是T175细胞培养瓶，用新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分多次洗涤培养瓶是用400mL新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分2次洗涤T175培养瓶；Day10+600步：补加新鲜培养基是补加600mL新鲜培养基；Day12MT步：对培养体系做微生物检测是将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷广其，王晶，李亚平，邱丽媛，赵进军，何文丽，
申请(专利权)人：中卫华医北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11