一种提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法技术

本发明专利技术公开了一种提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法，收集外周血的单个核细胞后进行诱导培养，诱导培养时在培养液中添加诱导增殖肽，利用诱导增殖肽作用于培养中的单个核细胞；所述诱导增殖肽为一种外源性多肽，序列如SEQ ID NO.1所示；所述培养液为含20％小牛血清的RPMI 1640培养液；所述培养液中还添加有γ干扰素、抗人CD3单克隆抗体和重组人IL‑2。本发明专利技术提供的方法可以显著提高CIK细胞的增殖率和杀伤力，有助于提高过继性细胞免疫治疗的效果。

Cell culture method for improving CIK cell proliferation rate and lethality

The invention discloses a method for improving CIK cell proliferation rate and lethality of the cell culture method of peripheral blood mononuclear cells collected after induced and cultured, induced when cultured in the culture medium added peptide induced proliferation of mononuclear cells, using peptide induced proliferation effect on cultured in; the proliferation induced by a peptide exogenous peptide sequence is shown as SEQ ID NO.1; the medium containing 20% calf serum RPMI 1640 medium; the culture medium added with gamma interferon and anti human CD3 monoclonal antibody and recombinant human IL 2. The method provided by the invention can significantly improve the proliferation rate and lethality of CIK cells, and is helpful to improve the effect of adoptive cellular immunotherapy.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法。
技术介绍
肿瘤的过继性细胞免疫治疗是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞(特异性和非特异性的)直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀肿瘤细胞，可作为手术、放疗、化疗的补充，以提高疗效和改善患者的生存质量。因此，近年来一直是肿瘤生物治疗最活跃的领域。细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer cells，CIK)是将人体外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞群，它具有增殖能力强、杀瘤活性高、杀瘤谱广等特点。CIK细胞能选择性杀伤肿瘤细胞，无严格的主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)限制性，特别是对于术后清除微小转移灶、防止癌的扩散和复发、提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重要作用。对于无法手术或对化疗耐受的中晚期肿瘤患者也可起到改善生活质量、延长生命的积极作用。提高CIK细胞的增殖率和杀伤力有助于提高过继性细胞免疫治疗的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种诱导CIK细胞的方法，以提高CIK细胞的增殖率和杀伤力。上述目的是通过如下技术方案实现的：一种提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法：收集外周血的单个核细胞后进行诱导培养，诱导培养时在培养液中添加诱导增殖肽，利用诱导增殖肽作用于培养中的单个核细胞；所述诱导增殖肽为一种外源性多肽，序列如SEQ ID NO.1所示。优选地，所述培养液为含20％小牛血清的RPMI 1640培养液。优选地，所述诱导增殖肽作用于单个核细胞的浓度为10-20μmol/mL。优选地，所述培养液中还添加有γ干扰素、抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2。优选地，所述γ干扰素在培养液中的浓度为800-1200U/mL，所述抗人CD3单克隆抗体在培养液中的浓度为20-100ng/mL，所述重组人IL-2在培养液中的浓度为500-1500U/mL。优选地，所述的提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法具体包括如下步骤：步骤S1，取外周血，收集外周血的单个核细胞部分，离心，弃上清液，获得单个核细胞；步骤S2，用完全培养液调整单个核细胞浓度为1×106/mL；所述完全培养液为含20％小牛血清的RPMI 1640培养液，含有800-1200U/mL的γ干扰素和10-20μmol/mL的诱导增殖肽；步骤S3，培养24小时后，加入20-100ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500-1500U/mL重组人IL-2，继续诱导培养；以后每隔2-3天用含20％小牛血清的RPMI 1640培养液半量换液，培养液中含20-100ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500-1500U/mL重组人IL-2；步骤S4，整个诱导培养过程为10-14天，即得高增殖率和杀伤率的CIK细胞。优选地，所述γ干扰素的浓度为1000U/mL。优选地，所述抗人CD3单克隆抗体的浓度为60ng/mL。优选地，所述抗人CD3单克隆抗体为OKT3、UCHT1、HIT3a中的一种或多种。优选地，所述重组人IL-2的浓度为1000U/mL。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的方法可以显著提高CIK细胞的增殖率和杀伤力，有助于提高过继性细胞免疫治疗的效果。附图说明图1为CIK细胞的增殖倍数；图2为CIK细胞对K562靶细胞的杀伤率。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本专利技术的技术方案。实施例1：CIK细胞的诱导制备包括如下步骤：步骤S1，采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集人外周血单个核细胞部分，离心，弃上清液，获得单个核细胞；步骤S2，用完全培养液调整单个核细胞浓度为1×106/mL；所述完全培养液为含20％小牛血清的RPMI 1640培养液，含有1000U/mL的γ干扰素和15μmol/mL的诱导增殖肽；步骤S3，培养24小时后，加入60ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1000U/mL重组人IL-2，继续诱导培养；以后每隔3天用含20％小牛血清的RPMI 1640培养液半量换液，培养液中含60ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1000U/mL重组人IL-2；抗人CD3单克隆抗体为OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，终浓度各为20ng/mL；步骤S4，整个诱导培养过程为12天，培养环境为5％CO2、37℃。培养结束后计数扩增倍数并进行细胞毒活性测定。实施例2：CIK细胞的诱导制备包括如下步骤：步骤S1，采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集人外周血单个核细胞部分，离心，弃上清液，获得单个核细胞；步骤S2，用完全培养液调整单个核细胞浓度为1×106/mL；所述完全培养液为含20％小牛血清的RPMI 1640培养液，含有800U/mL的γ干扰素和10μmol/mL的诱导增殖肽；步骤S3，培养24小时后，加入20ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500U/mL重组人IL-2，继续诱导培养；以后每隔2天用含20％小牛血清的RPMI 1640培养液半量换液，培养液中含20ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500U/mL重组人IL-2；抗人CD3单克隆抗体为OKT3；步骤S4，整个诱导培养过程为14天，培养环境为5％CO2、37℃。培养结束后计数扩增倍数并进行细胞毒活性测定。实施例3：CIK细胞的诱导制备包括如下步骤：步骤S1，采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集人外周血单个核细胞部分，离心，弃上清液，获得单个核细胞；步骤S2，用完全培养液调整单个核细胞浓度为1×106/mL；所述完全培养液为含20％小牛血清的RPMI 1640培养液，含有1200U/mL的γ干扰素和20μmol/mL的诱导增殖肽；步骤S3，培养24小时后，加入100ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1500U/mL重组人IL-2，继续诱导培养；以后每隔2天用含20％小牛血清的RPMI 1640培养液半量换液，培养液中含100ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1500U/mL重组人IL-2；抗人CD3单克隆抗体为OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，OKT3和UCHT1终浓度各为30ng/mL，HIT3a浓度各为40ng/mL；步骤S4，整个诱导培养过程为10天，培养环境为5％CO2、37℃。培养结束后计数扩增倍数并进行细胞毒活性测定。实施例4：实施例1的对比实施例，不添加诱导增殖肽包括如下步骤：步骤S1，采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集人外周血单个核细胞部分，离心，弃上清液，获得单个核细胞；步骤S2，用完全培养液调整单个核细胞浓度为1×106/mL；所述完全培养液为含20％小牛血清的RPMI 1640培养液，含有1000U/mL的γ干扰素；步骤S3，培养24小时后，加入60ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1000U/mL重组人IL-2，继续诱导培养；以后每隔3天用含20％小牛血清的RPMI 1640培养液半量换液，培养液中含60ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1000U/mL重组人IL-2；抗人CD3单克隆抗体为OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，终浓度各为2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：收集外周血的单个核细胞后进行诱导培养，诱导培养时在培养液中添加诱导增殖肽，利用诱导增殖肽作用于培养中的单个核细胞；所述诱导增殖肽为一种外源性多肽，序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：收集外周血的单个核细胞后进行诱导培养，诱导培养时在培养液中添加诱导增殖肽，利用诱导增殖肽作用于培养中的单个核细胞；所述诱导增殖肽为一种外源性多肽，序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：所述培养液为含20％小牛血清的RPMI 1640培养液。3.根据权利要求1所述的提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：所述诱导增殖肽作用于单个核细胞的浓度为10-20μmol/mL。4.根据权利要求1所述的提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：所述培养液中还添加有γ干扰素、抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2。5.根据权利要求4所述的提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：所述γ干扰素在培养液中的浓度为800-1200U/mL，所述抗人CD3单克隆抗体在培养液中的浓度为20-100ng/mL，所述重组人IL-2在培养液中的浓度为500-1500U/mL。6.根据权利要求1所述的提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法，其特征在于，具体包括如下步骤：步骤S1，取外周血，收集外周血的单个核细胞部分，离心，弃上清液，获得单个核细...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨廷伟，陈四海，陈子扬，朱晓翔，邓凯旋，谷鹏飞，朱荣富，
申请(专利权)人：青海七彩花生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：青海;63