本发明专利技术提供了一种人参提取物FQR1及其制备和用途，并提供了FQR1诱导培养DC-CIK细胞的方法，其包括外周血采集、肿瘤抗原获取、单个核细胞分离、洗涤、DC-CIK细胞的诱导、培养等步骤；本发明专利技术获得的人参提取物FQR1，可以有效提高DC-CIK细胞的增殖、提高DC-CIK细胞杀瘤活性、延长DC-CIK细胞治疗荷瘤小鼠的带瘤生存期。
【技术实现步骤摘要】
:本专利技术属于免疫治疗
，具体涉及利用人参提取物FQR-1诱导DC-CIK细胞增殖与分化，以提高其杀肿瘤活性。
技术介绍
:肿瘤细胞的生物治疗是除化学治疗、放射治疗和手术治疗以外新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自体免疫细胞抗癌的新型治疗方法。它已被国家卫生计生委列入允许临床应用的三类技术。其中应用肿瘤患者外周血细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK/DC-CIK细胞)治疗技术已广泛应用于临床。生物疗法包括细胞因子治疗、免疫细胞治疗、基因治疗、分子革E1向治疗和抗体革巴向治疗等。其核心技术为肿瘤患者自体外周血CIK/DC-CIK细胞体外培养及其回输技术。肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。肿瘤免疫治疗备受关注，已成为肿瘤治疗领域的热点。近年来，肿瘤免疫治疗的新进展不断，目前已在一些肿瘤类型如黑色素瘤，非小细胞肺癌等治疗中显示出强大的抗肿瘤活性，并已有肿瘤免疫治疗药物获得美国FDA (Food and Drug Administrat1n, FDA)批准临床应用。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。肿瘤免疫治疗有望成为继手术，化疗，放疗，靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。DC-CIK生物免疫疗法(或DC+CIK)是指与DC细胞共培养的CIK细胞。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-1nduced killers, CIK)是一类抗肿瘤抗病毒效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖。树突状细胞(dendritic cell, DC)是有效的专职抗原提呈细胞，成熟的DC可以通过II型组织相容性抗原(MHC-1I )等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。CIK细胞和DC细胞是细胞免疫治疗的2个重要组成部分，两者联合可确保高效的免疫反应。自体CIK细胞是在体外由多种细胞因子诱导患者自体外周血单个核细胞(PBMC)而生成的异质细胞群。恶性肿瘤患者的免疫机能存在不同程度的受损害，CD3+、CD8+、CD56+细胞数量降低，增殖后的CIK细胞具有T细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤的特点。与PBMC相比，CIK细胞中⑶3+、⑶8+、⑶56+细胞比例明显升高，CIK细胞对肿瘤细胞有很强的杀伤力，而且CIK细胞越多，杀瘤效果越好。CIK细胞己成为过继细胞免疫治疗的主要方法。自体外周血DC-CIK细胞是自体DC细胞和CIK细胞共同培养后生成的异质细胞群，DC和CIK共培养24h后，IL12的分泌量是CIK细胞单独培养的6.93倍，可以高表达CD3+、CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞，低表达CD4+CD25+Treg细胞，尽管DC细胞不具备直接杀伤肿瘤细胞作用，但DC细胞可以刺激CIK细胞的增殖，分泌多种肿瘤杀伤细胞因子，比如TNFa和干扰素等。自体外周血DC-CIK细胞抗肿瘤效果一般比CIK细胞好，但是制备成本高。自身DC细胞与自身肿瘤抗原共刺激后，可增强抗肿瘤免疫应答，目前常用于肿瘤细胞疫苗的临床预防。CIK细胞能够通过体外诱导而大量增殖，通常的CIK制备方法，是将分离的外周血单个核细胞用⑶3mAb、IL-1A和IL-2诱导，最终得到一定量的CIK细胞，但是此种培养方法可能导致最终CIK细胞的增值和细胞毒活性不够理想。CIK细胞杀伤肿瘤细胞主要通过以下四种途径:CIK细胞能通过不同的机制识别肿瘤细胞，从而通过细胞毒作用杀死肿瘤细胞；CIK细胞能够诱导肿瘤细胞凋亡，达到杀死肿瘤细胞的目的；CIK细胞分泌IL-2、IL-6、IFN- γ等多种抗肿瘤的细胞因子；肿瘤生物治疗的目标是，通过人为的干预，调节机体自身免疫系统，获得识别、抑制肿瘤细胞的功能。肿瘤免疫治疗具有以下的优势:免疫治疗不仅能够直接产生抗肿瘤作用，同时还能纠正患者的免疫系统，促进机体抗肿瘤的免疫能力；无放疗，化疗副作用，减轻患者痛苦；可用于已产生耐药性肿瘤患者的治疗；对于晚期肿瘤患者能够迅速缓解症状，提高生存质量；对术后肿瘤患者防止复发、远期抗肿瘤效果较好；可以单独使用，也可与其它治疗方法联合使用。单次有效，多次使用效果更佳。本专利技术所述人参提取物FQR1及其在肿瘤细胞免疫治疗中的应用，迄今尚未见有国内外的相关报道。
技术实现思路
:为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种利用人参提取物FQR1及其诱导DC-CIK的方法。经该法制备的FQR1-DC-CIK细胞杀瘤活性，较常规诱导的DC-CIK显著提尚ο本专利技术采用的技术方案是:利用人参提取物FQR1诱导DC-CIK细胞的培养，其特征在于向CIK或DC-CIK细胞培养液中加入人参提取物FQR1，诱导CIK或DC-CIK细胞增殖与分化，以提高CIK或DC-CIK细胞的杀瘤作用。所述向CIK或DC-CIK培养液中加入人参提取物FQR1诱导DC-CIK细胞增殖与分化，具体依次包括以下步骤:步骤1外周血采集:无菌抽取肿瘤患者外周血50ml，肝纳素抗凝并充分混匀，避免凝血;步骤2肿瘤抗原获取:室温条件下lOOOrpm离心10分钟，收集10ml上层血楽，将收集的血浆预先加入人参提取物FQR1的DC-CIK诱导培养基中。所得细胞沉淀用于分离单个核细胞；步骤3单个核细胞分离:所得细胞沉淀用生理盐水加至50ml洗涤，lOOOrpm离心10分钟。弃上清，再次洗涤。轻轻加至淋巴细胞分离液表面，1300rpm条件下离心20分钟。用灭菌的巴氏收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml —次性塑料离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀，再次洗涤离心；步骤4FQR1DC-CIK细胞培养:离心后弃上清，沉淀用含人参提取物FQR1的诱导培养基重悬，并用稀释液稀释计数，均分至4个75cm2—次性的细胞培养瓶中，放入37°C、5%C02(v/v)饱和湿度的培养箱中培养，培养期间根据细胞生长情况适时换液和扩增，直至细胞数达到回输所需。该步骤所述的FQR1DC-CIK诱导培养液中，人参提取物FQR1的浓度为0.0 lug/ml ?20mg/ml。本专利技术的积极效果是:应用人参提取物FQR1，可以有效增加巨噬细胞的吞噬能力和抗原递呈能力，促进T细胞分化和免疫双向调节。研究表明，通过该诱导培养基培养的DC-CIK细胞，其杀瘤作用在实验室检测可达到99.5%。体外实验显示，该方法培养的DC-CIK细胞杀瘤活性高于常规培养的细胞；动物实验显示，该法制备的FQR1-DC-CIK细胞治疗荷瘤小鼠，其肿瘤负荷可明显降低或消失，延长带瘤生存期。【附图说明】:图1:FQR1诱导免疫细胞DC-CIK细胞增殖 图2:FQR1诱导免疫细胞DC-CIK杀伤肿瘤细胞活性图3:FQR1诱导的当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人参提取物FQR1，其特征是，取生晒参，高速组织捣碎机粉碎，分别两次加入10倍量10mM pH7.4的Tris‑HCl(0.15MNaCl)缓冲液，充分搅拌，浸提12h，离心后收集上清液，合并两次的上清液，并向其中加入固体硫酸铵至终浓度为80％，搅拌均匀后4℃静置过夜离心，沉淀用蒸馏水洗涤3次后冻干，4℃透析过夜后冻干，即可收获人参提取物FQR1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨兆勇，李霞，张志斐，汪康游，白利平，张紫浓，李亚东，金媛媛，
申请(专利权)人：东营凤起生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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