用于免疫治疗的多克隆γδ T细胞制造技术

本文所提供的是一种扩大具有抗肿瘤、抗病毒以及抗细菌活性的多克隆γδT细胞的临床相关量的方法。多克隆γδTγδ细胞可靶向多种肿瘤，包括实体瘤以及其他病状，诸如病毒和细菌感染。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2013年10月25日提交的美国临时申请号61/895,626的优先权权益，其全部内容以引用的方式并入本文中。本专利技术根据由国防部授予的批准号10626252在美国政府支持下进行。政府对本专利技术具有某些权利。专利技术背景1.专利
本专利技术一般涉及医学和免疫学领域。在某些方面中，本专利技术的领域涉及免疫治疗。更具体地说，其涉及临床级多克隆γδT细胞的制备和使用此类细胞的治疗方法。2.相关技术说明人类γδT细胞具有展现一系列效应功能的先天和后天品质，包括在细胞接触后的细胞溶解(Bonneville等,2010)。肿瘤靶细胞的识别和后续杀伤是通过γ与δT细胞受体(TCR)链的异二聚体来实现。人类TCR可变(V)区界定14个独特的Vγ等位基因、3个独特的Vδ等位基因(Vδ1、Vδδ2和Vδ3)，以及5个Vδ，其与Va等位基因共用相同的命名法(Vδ4/Vα14、Vδ5/Vα29、Vδ6/Vα23、Vδ7/Vα36以及Vδ8/Vα38-2)(Lefranc,2001)。表达TCRα/TCRβ异二聚体的T细胞占外周血(PB)T细胞的约95％，并且在主要组织相容性复合物(MHC)分子的情形下识别肽(Turchinovich和Pennington,2011)。相比之下，TCRγδ配体经鉴定与MHC限制无关，但在PB中是罕见的(T细胞的1％-5％)(Bonneville等,2010；Kabelitz等,2007；Xu等,2011)。人类γδT细胞展现固有的溶解肿瘤细胞的能力并且有希望用于免疫治疗。因此，在癌细胞上存在许多TCRγδ配体，从而增加以下可能性：维持γδTCR的多克隆谱型的扩增方法对人类应用来说具有吸引力。Vγ9Vδ2T细胞的过继转移已经在癌症的研究性治疗中产生目标临床反应，但是尚未进行非Vγ9Vδ2T细胞的施用(Kondo等,2008；Lang等,2011；Nagamine等,2009；Nicol等,2011；Wilhelm等,2003)。在单倍体相合αβT细胞耗尽的造血干细胞移植(HSCT)的受体之中，白血病的长期缓解与增加的源自供体的Vδ1T细胞的植入频率有关(Godder等,2007；Lamb等,1999；Lamb等,1996；Lamb等,2001)。迄今没有报告描述Vδ1negVδ2neg T细胞的治疗效果，并且尚未将这个亚群与表达Vδ1和Vδ2TCR的T细胞直接比较。因此，在非Vγ9Vδ2谱系的认识与人类应用之间存在显著差距。氨基二膦酸盐(例如唑来膦酸(Zol)已被用于增殖用于临床用途的T细胞的Vγ9Vδ2亚群(Stresing等,2007；Thompson等,2010)。其他γδT细胞谱系不是通过氨基二膦酸盐增殖。尽管如此，已经使用Vγ9Vδ2γδT细胞作为癌症免疫疗法的临床试验已显示一些目标反应，但作为单一疗法没有疗效(Nicol等,2011；Wilhelm等,2003)。板结合抗体和细胞因子混合物已经被用于增殖更多样化的T细胞，但是(i)其未实现一致的Vδ1和Vδ1negVδ2neg频率，(ii)γδT细胞的绝对数目不是临床相关的(<108个细胞)，(iii)其未全面分析Vγ频率，并且(iv)它们不是临床可直接转化的，因为这些试剂不是全部以优良制造规范(GMP)质量可获得的(Dokouhaki等,2010；Kang等,2009；Lopez等,2000)。因此，极大地需要离体扩增γδT细胞的临床相关方法和由此产生的细胞。专利技术概述本文所提供的是一种扩大具有抗肿瘤、抗病毒以及抗细菌活性的多克隆γδT细胞的临床相关量的方法。γδT细胞可以靶向多种肿瘤，包括实体瘤以及其他病状，诸如病毒和细菌感染。在一个实施方案中，提供一种包含至少约109个经纯化的γδT细胞的细胞组合物。细胞组合物可包含至少约109、1010、1011个或更多个经纯化的γδT细胞。在一个方面中，经纯化的γδT细胞可以属于Vδ1、Vδ2以及Vδ1negVδ2neg TCR亚群。在一个方面中，经纯化的γδT细胞可表达Vδ1、Vδ2、Vδ3、Vδ5、Vδ7或Vδ8TCR链与Vγ2、Vγ3、Vγ7、Vγ8、Vγ9、Vγ10或Vγ11TCR链的任何组合。在一个方面中，经纯化的γδT细胞可以具有基本上相同的遗传物质。在一个方面中，经纯化的γδT细胞可以不含嵌合抗原受体。在一个方面中，细胞组合物可以不含NK细胞或αβT细胞。在一个方面中，γδT细胞可表达CD3。在其他方面中，γδT细胞可表达或共表达CD38、CD95、CD25、CD27、CD28、CD45或CCR7。在一个方面中，γδT细胞可能不表达CXCR4、CCR4、CLA、CD4、CD8、CD122、CD127、CD56、CD57或PD-1。在各个方面中，本专利技术实施方案的γδT细胞可以被基因编辑，以提高治疗潜力。这种基因编辑可以本领域中已知的任何手段，诸如通过使用人工核酸酶来进行。这种基因编辑可以通过表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)来使γδT细胞的特异性再定向。这种基因编辑可以通过改良归巢、细胞因子产生、再循环杀伤以及/或者改良的植入来改良γδT细胞的效力。在一个实施方案中，提供一种包含本实施方案的细胞组合物和药学上可接受的载剂的药物组合物。在一个实施方案中，提供一种制备本实施方案的细胞组合物的方法。该方法可包括获得包含第一多克隆γδT细胞群的细胞样品；以及在白介素-2(IL-2)和白介素-21(IL-21)存在下将第一多克隆γδT细胞群与人工抗原呈递细胞(aAPC)一起培养。在一些方面中，培养可离体进行有限的时间段来扩增T细胞群。在一个方面中，培养步骤可以还包括在氨基二膦酸盐(例如唑来膦酸)存在下进行培养。在一个方面中，细胞样品可为外周血样品或脐带血样品。在另一个方面中，细胞样品可获自组织。在另一个方面中，细胞样品可获自单一受试者。受试者可为供体或患者。在一些方面中，可以将从单一供体产生的γδT细胞输注至一个或多个同种异体受体中。在一个方面中，γδT细胞可为人类γδT细胞。在一些方面中，培养之前的初始γδT细胞群的纯化可包括诸如用顺磁珠粒选择或流式细胞术进行的分离/富集。此类选择可包括耗尽表达CD56的细胞和表达TCRαβ的细胞的样品。γδT细胞的纯度可为基于在对一种或多种γδTCR具特异性的单克隆抗体情况下的染色的TCR的存在。在一个方面中，aAPC可为转基因K562细胞。在一个方面中，aAPC可表达CD137L。在其他方面中，aAPC可能另外表达CD19、CD64、CD86或mIL15。在某些方面中，aAPC可表达至少一种抗CD3抗体克隆，诸如OKT3和/或UCHT1。在一个方面中，aAPC可以是经过灭活的(例如经过照射的)。在一个方面中，aAPC可能已经过测试并且证实不具有感染性物质。用于产生此类aAPC的方法是本领域中已知的。在一个方面中，第一多克隆γδT细胞群可包含约104至约106γδT细胞。在一个方面中，将第一多克隆γδT细胞群与aAPC一起培养可包括以约10:1至约1:10；约3:1至约1:5；约1:1至约1:3(γδT细胞比aAPC)的比率培养所述细胞；或其中可以得到的任何范围。举例来说，T细胞与aAPC共培养可以按约本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞组合物，其包含至少约109个纯化γδT细胞，其中所述γδT细胞：(a)属于Vδ1、Vδ2以及Vδ1negVδ2neg TCR亚群；(b)具有基本上相同的遗传物质；并且(c)不含嵌合抗原受体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.25 US 61/895,6261.一种细胞组合物，其包含至少约109个纯化γδT细胞，其中所述γδT细胞：(a)属于Vδ1、Vδ2以及Vδ1negVδ2neg TCR亚群；(b)具有基本上相同的遗传物质；并且(c)不含嵌合抗原受体。2.如权利要求1所述的细胞组合物，其中所述组合物不含NK细胞或αβT细胞。3.如权利要求1所述的细胞组合物，其中所述γδT细胞表达CD3。4.如权利要求1所述的细胞组合物，其中所述γδT细胞不表达CD57或PD-1。5.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的细胞组合物和药学上可接受的载剂。6.一种制备根据权利要求1-4中任一项所述的细胞组合物的方法，其包括：(a)获得包含第一多克隆γδT细胞群的细胞的样品；以及(b)将所述第一多克隆γδT细胞群与人工抗原呈递细胞(aAPC)在白介素-2(IL-2)和白介素-21(IL-21)存在下一起培养，由此制备根据权利要求1-4中任一项所述的细胞组合物。7.如权利要求6所述的方法，其还包括耗尽所述细胞样品中的
\t表达CD56和表达TCRαβ的细胞。8.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞样品是外周血样品、脐带血样品或组织样品。9.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞样品是获自单一受试者。10.如权利要求6所述的方法，其中所述第一多克隆γδT细胞群包含约104至约106个γδT细胞。11.如权利要求6所述的方法，其中所述aAPC是转基因K562细胞。12.如权利要求6所述的方法，其中所述aAPC表达CD137L。13.如权利要求12所述的方法，其中所述aAPC另外表达CD19、CD64、CD86以及mIL15。14.如权利要求11所述的方法，其中所述aAPC表达至少一种抗CD3抗体克隆。15.如权利要求14所述的方法，其中所述至少一种抗CD3抗体克隆是OKT3和/或UCHT1。16.如权利要求14所述的方法，其中所述aAPC表达OKT3和UCHT1。17.如权利要求6所述的方法，其中所述aAPC被灭活。18.如权利要求17所述的方法，其中所述aAPC被照射。19.如权利要求6所述的方法，其中所述aAPC已经过测试并且证实不含感染性物质。20.如权利要求6所述的方法，其中将所述第一多克隆γδT细胞群与aAPC一起培养包括以约10:1至约1:10(γδT细胞比aAPC)的比率培养所述细胞。21.如权利要求6所述的方法，其中所述培养物中的所述aAPC是每周补充的。22.如权利要求6所述的方法，其中将所述第一多克隆γδT细胞群与aAPC一起培养包括培养至少2周。23.如权利要求22所述的方法，其中将所述第一多克隆γδT细胞群与aAPC一起培养使得多克隆γδT细胞的数目至少增加100倍。24.如权利要求6所述的方法，其中步骤(b)还包括用氨基二膦酸盐处理所述培养物。25.如权利要求6所述的方法，其中所述γδT细胞是人类γδT细胞。26.一种制备根据权利要求1-4中任一项所述的细胞组合物的方法，其包括：(a)获得包含第一多克隆γδT细胞群的细胞的样品；以及(b)在至少一种抗CD3抗体克隆存在...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·J·N·库珀，D·C·丹尼格，
申请(专利权)人：得克萨斯州大学系统董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US