用于使多能干细胞分化为心肌细胞的方法技术

本申请涉及用于使多能干细胞(PSC)分化为心肌细胞的方法。此外，本申请涉及用于使人胚胎干细胞(hESC)和诱导型多能干细胞(iPSC)分化为确定的心肌细胞的方法，其基于化学成分确定的培养基诱导的连接步骤。

Method for differentiating pluripotent stem cells into cardiomyocytes

The present invention relates to a method for differentiating pluripotent stem cells (PSC) into cardiomyocytes. In addition, the present invention relates to a method for differentiation of human embryonic stem cells (hESC) and induced pluripotent stem cells (iPSC) into defined cardiac cells, and a culture medium based on chemical composition.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及用于使多能干细胞(PSC)分化为心肌细胞的方法。此外，本申请涉及用于使人胚胎干细胞(hESC)和诱导型多能干细胞(iPSC)分化为增殖心肌细胞的方法，该方法基于化学成分确定的培养基诱导的连接步骤。
技术介绍
许多年以来，多种细胞培养系统已用于临床前药物开发。但是，已建立的细胞模型仅部分反映药物相关疾病特异性生理学，因为它们源自致瘤组织或源自转化和无限增殖化细胞。具体而言，因为终末分化的心肌细胞显示具有有限的增殖潜能，所以它们不具有有效产生用于药物开发的细胞模型的能力。因此，存在对可在研究和药物开发中用作可靠的细胞模型的更多疾病相关人细胞类型的需要。人胚胎干细胞(hESC)和诱导型多能干细胞(iPSC)为研究人员提供了产生功能性人细胞类型(如心肌细胞、神经元细胞、胰细胞等)的巨大机会。用于体外分化纯hESC和iPSC来源的人心肌细胞(hESCM)培养物的稳健流程将是强大的工具，不仅增进对早期人心脏发生(cardiogenesis)的理解，还用心肌细胞作为非转化人细胞模型来在药物开发的临床前阶段测试药物功效，及在进入临床之前评估心脏毒性。此外，hESC来源的人心肌细胞为鉴定对心脏再生至关重要的途径打开了机会，并最终导致支持基于干细胞的疗法的临床应用。为了发展用于药物研究和开发的细胞测定模型，这类分化流程需产生理想地满足以下标准的细胞：a)稳健，具有高水平的可重复性；b)产生大量高度纯化的细胞类型；c)可在短时间内分化；d)产生可冷冻的细胞，以保证多种筛选活动的批次一致性；e)提供功能性和生理学相关性用于模拟疾病特异性读出。P.W.Burridge等综述了使多能细胞分化为心肌细胞的现有技术方法(P.Burridge,Keller,Gold,&Wu,2012)。迄今没有一种已知的流程满足以上标准。具体而言，通过已知流程获得的心肌细胞难以冷冻和解冻而不丧失任何功能特性。为了满足这些需要，我们发展了产生大量高度纯化的心肌细胞(至多95％)的新的分化方法。该分化流程是用确定的小分子来在10天的时间跨度内指导向心肌细胞系分化。为了进一步提高其纯度，通过用心肌细胞偏好的条件重新接种(replating)它们来富集心肌细胞。此外，随后可以冷冻心肌细胞，在液氮下保存，并再次解冻。已测试该心肌细胞符合几种用于药物研究和开发的筛选型式。本专利技术提供与现有技术流程相比在较短时间内和以显著提高的产率使多能干细胞分化为心肌细胞的改进方法。该新方法减轻了从多能干细胞获得拟胚体或小细胞团的必要性，并去除了迄今已知的方法的低可重复性和标准化的主要缺点。此外，高效率允许在药物产业中将这些确定的心肌细胞大规模用于药物发现和安全性评估、用于再生医学应用及用于体外疾病模拟。专利技术概述1.本文提供用于使多能干细胞分化为心肌细胞的方法，该方法包括步骤：a)提供密度为3-7x105/cm2的多能干细胞；b)在含有下式的化合物的无胰岛素培养基中孵育该细胞：在一个实施方案中，在含0.3-10μM该化合物的无胰岛素培养基中孵育该细胞。在一个实施方案中，步骤b)包括孵育该细胞12-48小时。在一个实施方案中，该方法还包括步骤c)在含Wnt-C59的无胰岛素培养基中孵育该细胞。在一个实施方案中，步骤c)包括在含1-10μMWnt-C59的无胰岛素培养基中孵育该细胞。在一个实施方案中，步骤c)包括孵育该细胞24-72小时。在一个实施方案中，在步骤之间在无胰岛素培养基中孵育该细胞24-48小时。在一个实施方案中，该方法还包括步骤d)在含胰岛素的培养基中孵育该细胞。在一个实施方案中，步骤b)、c)和d)的培养基包含维生素C。在一个实施方案中，该多能干细胞是诱导型多能干细胞。在一个实施方案中，该诱导型多能干细胞是人细胞。在一个实施方案中，该诱导型多能干细胞获自患有由心脏细胞功能异常引起的疾病的个体。在一个实施方案中，提供通过任意以上实施方案的方法获得的心肌细胞。在一个实施方案中，提供通过任意以上实施方案的方法获得的心肌细胞的生物银行(biobank)。在一个实施方案中，通过任意以上实施方案的方法获得的心肌细胞或心肌细胞的生物银行用作由心脏细胞功能障碍引起的疾病的体外模型。在一个实施方案中，提供包含通过任意以上实施方案的方法获得的心肌细胞或心肌细胞的生物银行的治疗组合物。任意以上实施方案可以单独存在或组合存在。附图简述图1：FACS分析鉴定处于分化第14天的高浓度心肌细胞。hESC和iPSC都产生相似的结果。A：人胚胎干细胞来源的心肌细胞。B：人诱导型多能干细胞来源的心肌细胞。图2：多次心肌细胞分化的FACS分析证明流程的稳健性。图3：FACS分析显示纯化方法改善心肌细胞的纯度。A：第14天5.5x105/cm2心肌细胞的60％纯度。B：附加纯化步骤后4.4x105/cm2心肌细胞的98％纯度。图4：免疫荧光染色——共焦显微镜分析显示心肌细胞典型的细胞中的α辅肌动蛋白和肌钙蛋白T条纹模式。绿色(*)：α辅肌动蛋白；红色(#)：肌钙蛋白；蓝色(+)：细胞核。图5：xCELLigent分析——异丙基肾上腺素提高多能干细胞来源的心肌细胞的跳动频率。图6：多能干细胞来源的心肌细胞在分化第14天和第18天解冻后显示高比例的存活心肌细胞数。在每个实验中，冷冻4x106个细胞。专利技术详述本专利技术提供与现有技术流程相比，在较短时间内和以显著提高的增殖心肌细胞产率，使多能干细胞分化为心肌细胞的改进方法。本文公开的用于使人胚胎干细胞(hESC)和诱导型多能干细胞(iPSC)分化为确定的心肌细胞的新方法基于化学成分确定的培养基诱导的连接步骤，在起始分化后仅10天(或更早：8天)后产生跳动细胞。在一个实施方案中，提供用于使多能干细胞分化为心肌细胞的方法，该方法包括步骤：a)提供密度为3-7x105细胞/cm2的多能细胞；b)在含有下式的化合物的无胰岛素培养基中孵育该细胞：3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮(CP21)按3-7x105细胞/cm2的密度(即非常高的密度)提供多能干细胞。在一个实施方案中，按5.5x105细胞/cm2的密度提供细胞。令人惊奇地，本方法的专利技术人发现，按高密度提供细胞提高了分化效率和心肌细胞产率。在一个实施方案中，在以步骤a)起始分化之前，用适宜的缓冲液或培养基洗涤按高密度提供的细胞，以去除任何死细胞。步骤b)的培养基是无胰岛素培养基。步骤b)的早期分化培养基中缺乏胰岛素很重要，因为之前的报道已显示，含有胰岛素的分化培养基阻断心脏发生(Lianu.a.,2013)。为了起始分化，在含有化合物21，(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮，本文中也称为“化合物21”或“CP21”；参见例如L.Gong等；Bioorganic&MedicinalChemistryLetters20(2010),1693-1696)的无胰岛素培养基中孵育细胞，以激活wnt途径。化合物21诱导心肌细胞分化的最适浓度依赖于附着于细胞容器的多能细胞的细胞密度。在使用不同细胞密度(1.8-11x105/cm2hESC或iPSC)和多种CP21(0-10μM)浓度的本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于使多能干细胞分化为心肌细胞的方法，所述方法包括步骤：a)提供3‑7x105/cm2密度的多能细胞；b)在含有下式化合物的无胰岛素培养基中孵育所述细胞：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.06 EP 14167201.41.用于使多能干细胞分化为心肌细胞的方法，所述方法包括步骤：a)提供3-7x105/cm2密度的多能细胞；b)在含有下式化合物的无胰岛素培养基中孵育所述细胞：2.权利要求1的方法，其中在含有0.3-10μM所述化合物的无胰岛素培养基中孵育细胞。3.权利要求1或2的方法，其中步骤b)包括孵育细胞12-48小时。4.权利要求1至3中任一项的方法，其还包括步骤c)在含有Wnt-C59的无胰岛素培养基中孵育所述细胞。5.权利要求4的方法，其中步骤c)包括在含有1-10μMWnt-C59的无胰岛素培养基中孵育所述细胞。6.权利要求4或5的方法，其中步骤c)包括孵育细胞24-72小时。7.权利要求1至6中任一项的方法，其中在步骤之间在无胰岛素培养基中孵育细胞24-48小时。8...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·布尔钦，S·施利希特，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH