一种液体微胶囊包埋、分化全能干细胞成心肌细胞的方法，包括如下步骤：（1）将全能干细胞和海藻酸钠DMEM培养基溶液混合均匀；（2）包埋有全能干细胞的海藻酸钠形成凝胶微胶囊；（3）加入到聚赖氨酸溶液中，形成海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳；（4）加入到柠檬酸钠溶液中，海藻酸钠凝胶的内核液化，海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳完好无损；（5）分离步骤（4）中含有干细胞团和海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳的凝胶微胶囊，定向诱导分化成心肌细胞。本发明专利技术通过海藻酸钠包埋，海藻酸钠/聚赖氨酸外壳保护，微胶囊内核液化提供了一种高效包埋、分化全能干细胞（胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞）成心肌细胞的方法。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及一种液体微胶囊包埋、分化全能干细胞成心肌细胞的方法。技术背景：全能干细胞是指具有无限分化潜能，能分化成所有组织和器官的干细胞，主要包括两大类；胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs)和诱导胚胎干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)，此类细胞被广泛分化成各种细胞，比如心肌细胞、神经元细胞、肝脏细胞等，用于发病机理的研究、新药筛选和细胞治疗等方面。对于心肌细胞，目前所有的技术手段主要通过二维平板的方式培养和诱导，该方法不但生产成本高，工艺难以放大，而且后续生物反应器的放大过程中，不管是以细胞微团（aggregates) 还是微载体（microcarrier）的形式，细胞都会在生物反应器中经历大的剪切力，这种持续不断的剪切力会使全能干细胞进行自主、无序分化，从而最终导致整个定向诱导的分化效率低下。
技术实现思路
：本专利技术针对现有技术存在的缺陷，提供一种液体微胶囊包埋、分化全能干细胞成心肌细胞的方法。这种方法既能实现全能干细胞向心肌细胞的分化，又能保护细胞不受生物反应器中剪切力的影响。为此，本专利技术采取如下技术方案：一种液体微胶囊包埋、分化全能干细胞成心肌细胞的方法，包括如下步骤：（1）将全能干细胞和质量分数0.5-3％的海藻酸钠DMEM培养基溶液混合均匀；（2）通过静电滴液法或气流喷射法方式，使细胞、海藻酸钠混合液流经26-28G的针头滴入0.1-0.6M氯化钙溶液中，静置３-10分钟，包埋有全能干细胞的海藻酸钠形成凝胶微胶囊；（3）分离步骤（２）中凝胶微胶囊，加入到质量分数0.01%-0.2%聚赖氨酸溶液中，放置2-10分钟，形成一层海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳；（4）分离步骤（３）中的具有海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳的凝胶微胶囊，加入到5-60mM柠檬酸钠溶液中，静置３-10分钟，海藻酸钠凝胶的内核液化，全能干细胞在液体内核中自动聚合成一个干细胞团，海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳完好无损；（5）分离步骤（4）中含有干细胞团和海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳的凝胶微胶囊，加入到心肌细胞定向诱导培养液中，之后转移至搅拌式生物反应器中培养，使接种细胞浓度在2-5万细胞每毫升，保持反应体系温度在35-37oC，体系中二氧化碳体积分数在4-7%，定向诱导分化成心肌细胞。采用海藻酸钠包埋、分化全能干细胞的方法，细胞团被一层海藻酸钠/聚赖氨酸外壳保护，可以使整个生产过程放大到生物反应器中，而不受剪切力的影响，同时生长因子、细胞代谢产物可以自由进出保护壳。作为优选，所述步骤（１）中的全能干细胞包括胚胎干细胞和诱导胚胎干细胞，混合均匀后全能干细胞的细胞浓度为0.1-10百万细胞/毫升，海藻酸钠DMEM培养基溶液中海藻酸钠质量分数1-2%。通过控制细胞在海藻酸钠溶液中的浓度，可以控制液体微胶囊中细胞团的大小，同时使细胞团的大小保持一致，保持整个生产工艺的稳定性。作为优选，所述步骤（２）中的氯化钙溶液摩尔浓度为0.1-0.5M。作为优选，所述步骤（３）中的聚赖氨酸溶液质量分数为0.01%-0.1%。利用不同浓度的聚赖氨酸可以有效地调控液体微胶囊外壳的厚度和分子通透性，不仅可以保证足够的外壳厚度、硬度，不至于被生物反应器中的剪切力破坏外，同时还可以调控进入液体微胶囊的分子大小，使小分子生长因子和细胞代谢产物自由出入保护壳，而对细胞有破坏性的大分子无法进入保护壳。作为优选，所述步骤（４）中的柠檬酸钠溶液摩尔浓度为10-55mM。一定浓度的柠檬酸钠使微胶囊内核液化，与未液化的微胶囊相对比，细胞由于不受周围固态微环境的限制，更有利于自由增殖。作为优选，所述步骤（４）中干细胞团大小为200μm。研究发现，只有200μm大小的细胞团具有最好的分化效率。所述步骤（5）定向诱导获得的心肌细胞，采用基因表达、蛋白表达和功能测试进行验证。本专利技术的有益效果：1 本专利技术通过海藻酸钠包埋，海藻酸钠/聚赖氨酸外壳保护，微胶囊内核液化提供了一种高效包埋、分化全能干细胞（胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞）成心肌细胞的方法。2本专利技术通过控制细胞在海藻酸钠溶液中的浓度，控制液体微胶囊中细胞团的大小，使细胞团的大小保持一致，保持整个生产工艺的稳定性及较好的分化效率。3本专利技术通过利用不同分浓度的聚赖氨酸有效调控液体微胶囊外壳的厚度和分子通透性，不但可以保护细胞团不被生物反应器中的剪切力破坏，同时还可以调控进入液体微胶囊的分子大小，使小分子生长因子和细胞代谢产物自由出入保护壳，而对细胞有破坏性的大分子无法进入保护壳。4本专利技术通过微胶囊内核液化，使细胞不受周围固态微环境的限制，更有利于其自由增殖。附图说明：图1为液体微胶囊包埋、分化全能干细胞成心肌细胞步骤流程图；图2为全能干细胞在液化和未液化微胶囊微环境中的生长曲线图；图3为定向分化的心肌细胞特有基因的表达图；图4为分化的心肌细胞特有蛋白的表达图；图5为分化的心肌细胞功能测试图。具体实施方式：下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1图1为海藻酸钠包埋、聚赖氨酸成壳、内核液化和全能干细胞团分化成心肌细胞示意图，具体包括如下步骤：（1）将胚胎干细胞(ESCs) 均匀混合于1.5%的海藻酸钠DMEM培养剂溶液中，使其细胞密度达到5百万细胞/毫升，将细胞、海藻酸钠混合液至于含有27G针头的注射器中；（２）用气流喷射法，通过27G的针头将细胞、海藻酸钠混合液快速滴入0.1M氯化钙溶液中，静置5分钟并分离出海藻酸钠凝胶微胶囊，之后用DMEM基础培养基清洗2-3次；（３）将步骤（２）中包埋有全能干细胞的凝胶微胶囊置于0.05%的聚赖氨酸溶液中2分钟形成一层海藻酸钠/聚赖氨酸保护外壳，并取出一半微胶囊作为未液化对照组，图2为细胞在液化和未液化微胶囊微环境中的生长曲线图，与未液化对照组相比，液化后微胶囊更有利于细胞的生长；（4）将步骤（３）中的具有海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳的凝胶微胶囊静置于55mM的柠檬酸钠溶液中5分钟，海藻酸钠凝胶的内核将被液化，干细胞在液体内核中自动聚合成一个细胞团，海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳完好无损，内核完全液化后，用细胞培养液清洗2-3次；（5）将含有干细胞团的具有海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳的凝胶微胶囊加入到心肌细胞定向诱导培养液中，并转移至500毫升搅拌式生物反应器中培养，保持反应体系温度在35-37oC，体系中二氧化碳体积分数在4-7%，每天定期更换50%的诱导培养液，定向诱导分化成心肌细胞。14-21天后，液化胶囊内的细胞分化成心肌细胞，开始自主跳动，对心肌细胞进行基因表达、蛋白表达、细胞功能测试验证。图3为心肌细胞，Nkx2.5, Gata4, Tbx5, ANF, a-MHC和Tbx20等特有基因的表达图，图4为心肌细胞，肌钙蛋白I（cTnI）和辅肌动蛋白（a-Actinin)等特有蛋白的表达图，图5为心肌的细胞功能测试图，显示细胞跳动随3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (IBM本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种液体微胶囊包埋、分化全能干细胞成心肌细胞的方法，其特征在于,所述方法包括如下步骤：（1）将全能干细胞和质量分数0.5‑3％的海藻酸钠DMEM培养基溶液混合均匀；（2）通过静电滴液法或气流喷射法方式，使细胞、海藻酸钠混合液流经26‑28G的针头滴入0.1‑0.6M氯化钙溶液中，静置３‑10分钟，包埋有全能干细胞的海藻酸钠形成凝胶微胶囊；（3）分离步骤（２）中凝胶微胶囊，加入到质量分数0.01%‑0.2%聚赖氨酸溶液中，放置2‑10分钟，形成一层海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳；（4）分离步骤（３）中的具有海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳的凝胶微胶囊，加入到5‑60mM柠檬酸钠溶液中，静置３‑10分钟，海藻酸钠凝胶的内核液化，全能干细胞在液体内核中自动聚合成一个干细胞团，海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳完好无损；（5）分离步骤（4）中含有干细胞团和海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳的凝胶微胶囊，加入到心肌细胞定向诱导培养液中，之后转移至搅拌式生物反应器中培养，使接种细胞浓度在2‑5万细胞每毫升，保持反应体系温度在35‑37ºC，体系中二氧化碳体积分数在4‑7%，定向诱导分化成心肌细胞。
【技术特征摘要】
1.一种液体微胶囊包埋、分化全能干细胞成心肌细胞的方法，其特征在于,所述方法包括如下步骤：
（1）将全能干细胞和质量分数0.5-3％的海藻酸钠DMEM培养基溶液混合均匀；
（2）通过静电滴液法或气流喷射法方式，使细胞、海藻酸钠混合液流经26-28G的针头滴入0.1-0.6M氯化钙溶液中，静置３-10分钟，包埋有全能干细胞的海藻酸钠形成凝胶微胶囊；
（3）分离步骤（２）中凝胶微胶囊，加入到质量分数0.01%-0.2%聚赖氨酸溶液中，放置2-10分钟，形成一层海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳；
（4）分离步骤（３）中的具有海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳的凝胶微胶囊，加入到5-60mM柠檬酸钠溶液中，静置３-10分钟，海藻酸钠凝胶的内核液化，全能干细胞在液体内核中自动聚合成一个干细胞团，海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳完好无损；
（5）分离步骤（4）中含有干细胞团和海藻酸钠/聚赖氨酸保护壳的凝胶微胶囊，加入到心肌细胞定向诱导培养液中，之后转移至搅拌式生物反应器中培养，使接种细胞浓度在2-5万细胞每毫升，保持反应体系温度在35-37oC，体系中二氧化碳体积分数在4-7%，定向诱导分化成心肌细胞。
2.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：荆东辉，
申请(专利权)人：荆东辉，
类型：发明
国别省市：天津;12
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