一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法。本发明专利技术所提供的体外培养视网膜色素上皮细胞的方法，包括如下步骤：(1)制备具有极性的单层视网膜色素上皮细胞；(2)制备视网膜神经层；(3)构建视网膜色素上皮细胞与视网膜神经层的共培养体系。本发明专利技术所提供的RPE细胞与视网膜神经层共培养的方法，形成Bruch膜‑RPE细胞‑视网膜神经层的“三明治结构”，既模拟了Bruch膜又保持RPE与视网膜神经层直接共培养，完全模拟了RPE体内生长环境，提供了一个有价值的研究体内环境下RPE细胞生长、分化、功能的实验平台。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法。
技术介绍
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)是具有极性的、单层上皮细胞，在视网膜中RPE基底部为Bruch膜，顶端为视网膜神经层。RPE能够吞噬感光细胞外节、分泌营养因子、参与视循环代谢，组成血—视网膜屏障，对于正常的视网膜功能具有十分重要的功能，许多致盲性眼病的发生都与RPE的功能障碍有关，如老年性黄斑变性、视网膜色素变性等。因此，研究RPE的功能具有十分重要的意义。将RPE细胞进行体外培养是研究RPE的必备方法，但一般的细胞培养方法是将RPE细胞培养在普通培养板上，该方法与真实的体内环境有很大差异，无法真实有效地评估细胞在体内环境中的功能。许多研究致力于采用超薄的小孔径PET膜人工模拟Bruch膜，并将RPE细胞培养在这种人工材料上(Sonoda,S.，et al.Nat Protoc，2009，4:662-673)，发现RPE细胞能够在这种材料上形成具有极性的、单层细胞。这种体外培养RPE细胞的方法虽然一定程度上更接近于体内生长环境，但仍然忽视了视网膜神经层对于RPE生长、分化、功能的影响。而视网膜神经层在体外培养过程中极易飘动、卷缩，使得难以与RPE细胞进行直接共培养。因此，需要一种有效的培养体系，既模拟了Bruch膜又保持RPE与视网膜神经层直接共培养，完全模拟RPE体内生长环境，为深入研究RPE细胞在体内环境中的生长、分化和功能提供一种实验平台。
技术实现思路
本专利技术提供了一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法。本专利技术所提供的体外培养视网膜色素上皮细胞的方法，包括如下步骤：(1)制备具有极性的单层视网膜色素上皮细胞；(2)制备视网膜神经层；(3)构建视网膜色素上皮细胞与视网膜神经层的共培养体系：将所述步骤(2)制备的视网膜神经层移到已接种了所述步骤(1)制备的视网膜色素上皮细胞的Transwell培养小室，使所述视网膜神经层的感光细胞层朝向所述视网膜色素上皮细胞，加入培养基，置细胞培养箱内于37℃和5％CO2条件下共培养，2～3天换液；所述培养基为以Neurobasal-A培养基为基础，加入如下质量百分比浓度的组分：2％B-27添加剂、1％N-2添加剂和0.4％L-谷氨酰胺。所述步骤(1)中所述制备具有极性的单层视网膜色素上皮细胞包括如下步骤：将人胚胎干细胞H1不传代连续培养35～45天后，出现直径1mm大小的色素灶，将色素灶挑出后接种在培养板中，从色素灶中长出的细胞即为视网膜色素上皮细胞，待生长至融合时，经质量百分比浓度为0.25％胰蛋白酶37℃消化10min，计数，以1×105/cm2的密度将所述视网膜色素上皮细胞均匀接种于已包被过基质胶的Transwell培养小室的上层；移至细胞培养箱中，于37℃、5％CO2培养视网膜色素上皮细胞14天后形成具有极性的单层视网膜色素上皮细胞。所述培养视网膜色素上皮细胞所需的培养基为：高糖DMEM基础培养基中添加质量百分比浓度为20％KSR、质量百分比浓度1％非必需氨基酸和1mM L-谷氨酰胺。所述步骤(2)中所述制备视网膜神经层包括如下步骤：准备好出生后30天Long Evens大鼠的离体眼球，利用视网膜取出器在5秒内完整取出离体眼球的视网膜神经层，将取出的视网膜神经层剪成梅花状，保持展平。所述步骤(3)还包括将视网膜压平器压在所述视网膜神经层上，以保持所述视网膜神经层展平以及所述视网膜神经层与所述视网膜色素上皮细胞的紧密接触的步骤。本专利技术中，RPE细胞是原代分离或经过各种干细胞分化来的RPE细胞或经基因修饰的RPE细胞。所述干细胞是胚胎干细胞、诱导多能干细胞、各种成体干细胞、以及采用治疗性克隆技术制备的干细胞等。本专利技术中，若视网膜神经层来源于不同种属、不同遗传背景，可进行相关的免疫排斥研究。根据实验的设计的需要，检测RPE细胞的生长、分化及功能，包括细胞的增殖、分化、吞噬感光细胞外节、分泌营养因子，参与视循环代谢等，为深入研究RPE细胞在体内环境中的功能提供可靠实验依据。本专利技术所提供的RPE细胞与视网膜神经层共培养的方法，形成Bruch膜-RPE细胞-视网膜神经层的“三明治结构”，既模拟了Bruch膜又保持RPE与视网膜神经层直接共培养，完全模拟了RPE体内生长环境，提供了一个有价值的研究体内环境下RPE细胞生长、分化、功能的实验平台。本专利技术为一种完全模拟体内环境的RPE细胞培养方法，提供了一个有价值的研究体内环境下RPE细胞生长、分化、功能的实验平台。附图说明图1中A-C为RPE细胞培养在Transwell膜上的示意图，及细胞形态、细胞极性的免疫荧光鉴定图。图2为分离的视网膜神经层剪成梅花状后的示意图。图3为视网膜压平器的结构示意图图4为具有极性的单层RPE细胞与视网膜神经层共培养的示意图。图5为共培养后检测RPE细胞的吞噬功能。图6为共培养后Western blot检测RPE细胞RPE65的表达。图7为共培养后检测RPE细胞的超微结构。具体实施方式下述实施例中所使用的检测、鉴定、纯化方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。实施例1、视网膜色素上皮细胞与视网膜神经层共培养的方法一、人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞与大鼠视网膜神经层共培养的方法1、制备具有极性的单层RPE细胞：将人胚胎干细胞H1(购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，货号为SCSP-306，记载过人胚胎干细胞H1的非专利文献是：郭新，秦洁，张键荣，唐爱发，余振东，石敏，桂耀庭，蔡志明；人胚胎干细胞H1培养条件的优化；解剖学杂志，2008年03期)不传代连续培养35～45天后，出现直径约1mm大小的色素灶，将色素灶挑出后接种在培养板中，从色素灶中长出的细胞即为RPE细胞，待生长至融合时，经0.25％(质量百分比浓度)胰蛋白酶37℃消化10min，计数，以1×105/cm2的密度将RPE细胞均匀接种于已包被过基质胶(354230，美国BD公司)的Transwell培养小室(3470,美国Corning公司)(孔径为0.4um的PET膜)的上层。小心移至细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养。2～3天半量换液，培养14天后可形成具有极性的单层RPE细胞，参见图1。RPE细胞培养所需的培养基为：高糖DMEM基础培养基，20％(质量百分比浓度)KSR(KnockOutTMSerum Replacement)，1％(质量百分比浓度)非必需氨基酸，1mML-谷氨酰胺，均购自美国Invitrogen公司。2、制备视网膜神经层：准备好出生后30天Long Evens大鼠(购买自中国人民解放军第三军医大学实验动物中心)的离体眼球，利用“视网膜取出器”(专利技术专利号：ZL201310162184.7；公布号：CN103211677)和“视网膜神经细胞层体外分离制备的方法”(专利技术专利申请号：201310162180.9；授权公告号：CN 103234774B)，在5秒内快速完整的取出离体眼球的视网膜神经层，视网膜神经层剪成梅花状，保持展平，参见图2。取出视网膜神经细胞层的具体步骤如下：A.清洁眼球：首本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法，包括如下步骤：(1)制备具有极性的单层视网膜色素上皮细胞；(2)制备视网膜神经层；(3)构建视网膜色素上皮细胞与视网膜神经层的共培养体系：将所述步骤(2)制备的视网膜神经层移到已接种了所述步骤(1)制备的视网膜色素上皮细胞的Transwell培养小室，使所述视网膜神经层的感光细胞层朝向所述视网膜色素上皮细胞，加入培养基，于37℃和5％CO2条件下共培养，2～3天换液；所述培养基为以Neurobasal‑A培养基为基础加入如下质量百分比浓度的组分：2％B‑27添加剂、1％N‑2添加剂和0.4％L‑谷氨酰胺。

【技术特征摘要】
1.一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法，包括如下步骤：(1)制备具有极性的单层视网膜色素上皮细胞；(2)制备视网膜神经层；(3)构建视网膜色素上皮细胞与视网膜神经层的共培养体系：将所述步骤(2)制备的视网膜神经层移到已接种了所述步骤(1)制备的视网膜色素上皮细胞的Transwell培养小室，使所述视网膜神经层的感光细胞层朝向所述视网膜色素上皮细胞，加入培养基，于37℃和5％CO2条件下共培养，2～3天换液；所述培养基为以Neurobasal-A培养基为基础加入如下质量百分比浓度的组分：2％B-27添加剂、1％N-2添加剂和0.4％L-谷氨酰胺。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述制备具有极性的单层视网膜色素上皮细胞包括如下步骤：将人胚胎干细胞H1不传代连续培养35～45天后，出现直径1mm大小的色素灶，将色素灶挑出后接种在培养板中，从色素灶中长出的细胞即为视网膜色素上皮细胞，待生长至融合时，经质量百分比浓度为0.25％胰蛋白酶37...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴畏，徐海伟，曾玉晓，彭广华，阴正勤，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50