模拟胰岛的制造方法技术

一种模拟胰岛的制造方法，其包含：在细胞培养孔内以1500个～5000个/孔来接种多能细胞，制作所述多能细胞的规定尺寸的聚集体的工序；和在所述细胞培养孔内以非贴壁状态培养所述聚集体，使其向着包含胰岛前体细胞或胰岛细胞的细胞分化的工序。

【技术实现步骤摘要】
技术分野本专利技术涉及一种使多能干细胞、优选为人多能干细胞向胰岛细胞高效地分化诱导的模拟胰岛(疑似膵島)的制造方法。
技术介绍
作为糖尿病、特别是1型糖尿病的治疗手段，胰脏移植、胰岛移植是有效的，但是，脏器供体数量少、必须服用用于抑制免疫排斥的免疫抑制剂等方面成为严峻的课题。另一方面，正在使用来自于小鼠、人的细胞，广泛进行由诱导多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞来分化诱导胰岛细胞的研究。专利文献1公开了使用TGF-β等刺激因子诱导内胚层细胞、特别是胰岛细胞的方法。但是，该文献虽然公开了将细胞的命运诱导为内胚层系统、特别是胰岛细胞所必须的刺激因子，但是对于诱导时的细胞群的形态是维持平面结构还是形成立体聚集块则没有公开，此外，对于此时的细胞群的尺寸的控制方法等也没有公开。专利文献2中公开了：在包含带正电的纳米尺寸的纤维或粒子的基质上培养胚胎干细胞(ES细胞)或iPS细胞，不使用饲养细胞地由多能干细胞诱导胰岛细胞的方法。但是，对于形成聚集体则没有记载和教导。非专利文献1中公开了：由人多能干细胞分化诱导胰岛细胞后，使其形成细胞聚集体、制作模拟胰岛的方法。此外公开了：通过移植该模拟胰岛，糖尿病模型小鼠的糖尿病状态得到改善。该文献中，在使细胞于培养皿底面上进行贴壁培养的状态下进行分化诱导，在该过
程中使细胞群从培养皿底面分离进行非贴壁培养(悬浮培养)，从而形成聚集体。但是，聚集体的形成依赖于悬浮培养中细胞群彼此的偶然性粘附，因此其尺寸是不可控的。专利文献3公开了：利用细胞无法贴壁的水凝胶基材构成凹部、使接种于其中的细胞形成聚集块的方法及器件。但是，该文献中并未公开用于由多能干细胞开始的分化诱导的方法。此外存在如非专利文献2、非专利文献3中记载那样的、通过搅拌培养法形成的聚集体状态的胰岛细胞分化诱导法。专利文献4中列举了在利用表面改性而抑制了细胞贴壁的培养皿中形成细胞聚集块的方法、及作为有助于聚集块的尺寸的因子的接种细胞的密度、培养液中的血清浓度。列举了如下方法：通过在培养皿底面中限制可发生细胞贴壁的区域，结果限制所生成的聚集块的尺寸。但是，该文献中并未公开用于分化诱导的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利第8859286号说明书专利文献2：日本特开2011-115161号公报专利文献3：日本专利第5039715号说明书专利文献4：日本特开2007-135593号公报非专利文献非专利文献1：DIABETES,VOL.61,AUGUST 2012,2016-2029非专利文献2：PLoS ONE.,VOL.7,May 2012,e37004,Thomas C.Schulz等，乔治亚大学、USA非专利文献3：Cell.VOL.159,Oct 2014,428-439,Felicia W Pagliuca等，Harvard University,USA
技术实现思路
专利技术所要解决的问题如上所述，以往一直在尝试由多能干细胞诱导胰岛细胞的方法，在效率、品质等方面，未充分得到实用的模拟胰岛。此外，操作也复杂。因此，本专利技术的课题在于，提供一种利用简易的操作使多能细胞高效地向着胰岛前体细胞或胰岛细胞分化诱导从而制造适合于移植治疗等的实用的模拟胰岛的方法。需要说明的是，本说明书中，关于“模拟胰岛”，相对于由生物体的胰脏摘出的胰岛，是指在生物体外由干细胞制作的组织。模拟胰岛至少在其内部包含胰岛素分泌细胞，例如，采取细胞团块结构。作为模拟胰岛，例如可以列举由胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)等干细胞制作的组织，由生物体中所含的干细胞等其它多能干细胞制作的组织也包含在“模拟胰岛”中。用于解决问题的方法为了解决上述课题，本专利技术提供一种模拟胰岛的制造方法，其包含：在细胞培养孔内(例如，直径200μm～800μm、深度400μm～1000μm)以1500个～5000个/孔来接种多能细胞，制作前述多能细胞的规定尺寸的聚集体的工序；和在前述细胞培养孔内以非贴壁状态培养所形成的前述聚集体，随着时间推移适当改变培养液组成，从而使其向着包含胰岛前体细胞或胰岛细胞的细胞团块分化的工序。本专利技术例如可以通过前述孔使用具有半球状的底部的孔来实现，能够使多个孔中的聚集体的大小大致均匀地进行分化工序。本专利技术可以优选使用例如水凝胶制微孔板。专利技术效果根据本专利技术的方法，与现有的方法相比，能够以简易的操作使多能细胞向着胰岛前体细胞或胰岛细胞高效地分化诱导。具体而言，通
过控制接种细胞数、制作尺寸均匀的细胞聚集体、在1个孔内保持1个细胞聚集体的状态下(即，在不与其它细胞聚集体接触的状态下)进行分化诱导，从而能够将细胞聚集体的尺寸控制在一定的范围，实现均匀的分化诱导效率。即，根据本专利技术的方法，由于氧气、营养成分容易扩散到聚集体的中心部，因此能够实现高细胞存活率。此外，通过避免聚集体间的接触、在1个孔内保持1个细胞聚集体、以该细胞聚集体的状态进行分化诱导，从而无需在分化诱导过程中的不期望的时期将细胞剥离、进而无需在规定的分化培养期后回收细胞而进行聚集体化，具有以下优点：操作得以简化；仅需要进行培养液的更换作业直至分化诱导的最终阶段，能够实现自动化；与利用贴壁培养的现有方法相比，分化诱导效率也得到改善；认为更接近于形成立体结构地进行的生物体中的发育过程，因此可能能够诱导出与现有技术相比性质更接近成体胰岛的胰岛细胞。附图说明图1是示出可用于本专利技术的方法的培养器的一个方式的图。图2是示出使实施例中的iPS细胞向着胰岛细胞分化诱导的条件的图。图3(A)是示出分化诱导过程中聚集体的形态及由琼脂糖微孔板回收的细胞聚集体的形态的照片。图3(B)是示出分化诱导过程中细胞聚集体的直径分布的图。图4是示出分化诱导第3天(a)和分化诱导第20天(b)的聚集体的免疫染色结果的照片。图5是示出使用分化诱导第34天获得的聚集体考察胰岛素分泌的结果的图。图6是示出在制作细胞聚集体时根据接种细胞数的存活率的差异的图(照片)。图7是示出对聚集体培养时和贴壁培养时的、诱导初期阶段向胚体内胚层细胞的分化效率进行比较的结果的图(流式细胞术；FACS)。图8是示出对聚集体培养时和贴壁培养时的、诱导后期阶段向胰
岛细胞的分化效率进行比较的结果的图(FACS)。图9是示出对聚集体培养时和贴壁培养时的、诱导后期阶段向胰岛细胞的分化效率进行比较的结果的图(RT-PCR)。任一图中，左侧表示贴壁培养的结果，右侧表示聚集体培养的结果。具体实施方式(多能干细胞)本专利技术中，多能干细胞是指具有能够分化为存在于生物体中的多种细胞的多能性、且同时具有增殖能力的干细胞，包含至少可诱导为本专利技术中使用的胰岛前体细胞的任意细胞。对多能干细胞没有特别限制，包含例如胚胎干(ES)细胞、来自于通过核移植而获得的克隆胚胎的胚胎干(ntES)细胞、多潜能生殖干细胞(“mGS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)、诱导多能干(iPS)细胞等。从制造工序中能够以不破坏胚胎、卵细胞等的方式获得的观点出发，优选的多能干细胞为iPS细胞。iPS细胞的制造方法在本领域中是公知的，可通过向任意的体细胞导入重编程因子而制造。其中，重编程因子可以例示出例如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、So本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种模拟胰岛的制造方法，其包含：在细胞培养孔内以1500个～5000个/孔来接种多能细胞，制作所述多能细胞的直径200μm～350μm的聚集体的工序；和在所述细胞培养孔内以非贴壁状态培养所述聚集体，使其向着包含胰岛前体细胞或胰岛细胞的细胞分化的工序。

【技术特征摘要】
2015.04.16 JP 2015-0843601.一种模拟胰岛的制造方法，其包含：在细胞培养孔内以1500个～5000个/孔来接种多能细胞，制作所述多能细胞的直径200μm～350μm的聚集体的工序；和在所述细胞培养孔内以非贴壁状态培养所述聚集体，使其向着包含胰岛前体细胞或胰岛细胞的细胞分化的工序。...

【专利技术属性】
技术研发人员：岩田博夫，小长谷周平，平野邦生，
申请(专利权)人：国立大学法人京都大学，爱科来株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP