一种用于细胞培养基的玉米活性肽添加剂制造技术

本发明专利技术提供一种用于细胞培养基的玉米活性肽添加剂，所述玉米活性肽添加剂中分子量小于1000道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比≥90%，并且所述低聚肽至少包括AP、SAP、PAL、VNAP、PSSQ、TQPGPQ中的一种或多种。本发明专利技术的玉米活性肽添加剂可以与多种基础培养基进行复配，用于对多种动物细胞进行无血清培养，其不仅大大降低了细胞培养基的成本，减少了动物源成分所带来的污染等问题，还能够促进细胞增殖，提高细胞活力以及增强细胞产物的表达。

【技术实现步骤摘要】
一种用于细胞培养基的玉米活性肽添加剂
本专利技术涉及一种细胞培养基添加剂，特别是涉及一种用于细胞培养基的玉米活性肽添加剂。
技术介绍
培养基是决定体外培养细胞生长代谢的最直接、最重要的环境因素。动物细胞培养基通常含有血清等动物源添加物，而随着全球疯牛病的流行爆发，血清等动物来源添加物的使用，给生物制药工业带来感染性海绵状脑病（TSEs）病毒及其它危险物质的安全性风险骤然上升。全世界的药品监管机构要求药物生产商在制药生产中减少牛源成分的使用，相关立法机关也越来越反对在制药领域使用牛血清等动物源成分。美国食品及药品管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）严格控制在商业化生产培养基过程中使用动物源成分，以保证病人最终的服药安全。同时，血清及其他动物源的培养基添加物中含有生长因子、转运蛋白、贴壁因子、激素等大分子蛋白质，为抗体药物、疫苗等生物制品后期分离纯化带来压力，最终影响产品得率，增加生产成本。因此，非动物源细胞培养添加物的开发及应用符合当前的发展方向，目前已成为动物细胞体外培养及生物制药领域的重要课题。玉米黄粉是玉米经湿磨法工艺制得粗淀粉乳，再经蛋白质分离得到麸质水，然后浓缩干燥制得的，其是玉米湿法加工淀粉时的主要副产物，含有60%以上的蛋白质，还含有无机盐和多种维生素。玉米活性肽是以玉米黄粉为原料，经预处理、生物酶水解、多级分离提纯、浓缩干燥等工艺制备出的小分子肽类混合物，其是天然玉米蛋白资源生物加工和转化利用领域的尖端产品。玉米活性肽来源于植物蛋白，避免了血清等动物性成分中潜在的病毒微生物污染等问题；其批次间质量一致，有利于提高细胞产品生产的稳定性；其不含大分子蛋白，有益于细胞产品下游分离纯化。玉米活性肽营养物质丰富，在其加工及储藏过程中易受细菌微生物污染，进而产生大量细菌内毒素，将其作为细胞培养添加剂使用时会改变细胞形态、破坏细胞膜结构、诱导细胞凋亡等，对体外培养的细胞生长产生不利影响。除此之外，由于不同的加工工艺对制备的玉米活性肽产品的组成具有较大影响，而动物血清成分较为复杂，很多成分至今尚不清楚，因此无法确定某种或某些成分的存在或者缺失是否会对细胞的生长产生不良影响，从而给玉米活性肽在无血清培养基添加剂上的应用造成一定的困难。
技术实现思路
本专利技术提供了一种玉米活性肽添加剂及其应用，该玉米活性肽内毒素含量低，在作为细胞培养基添加剂应用时，可与多种基础培养基进行复配，用于对多种细胞系进行无血清培养，并且还能促进细胞增殖，提高细胞活力以及增强细胞产物表达。本专利技术还提供一种用于细胞培养基的玉米活性肽的制备方法，其操作简便，酶解效率高，并且可将小分子的活性肽与大分子蛋白、细菌内毒素及小分子盐类进行高效地分离，适合大规模工业化生产。本专利技术提供的一种用于细胞培养基的玉米活性肽添加剂，其中分子量小于1000道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比≥90%，并且所述低聚肽至少包括AP、SAP、PAL、VNAP、PSSQ、TQPGPQ中的一种或多种。进一步地，所述低聚肽还包括AY、NAP、PVIN、AYPQ中的一种或多种。进一步地，所述玉米活性肽添加剂中内毒素的含量<200EU/g，特别是内毒素含量<50EU/g。根据本专利技术提供的玉米活性肽添加剂，其是通过依次采用非特异性蛋白酶和特异性蛋白酶对玉米黄粉进行酶解后，经分离纯化制得的。本专利技术所述的非特异性蛋白酶指的是对所作用的底物的特异性低、具有较宽的底物特异性的一类蛋白酶，如碱性蛋白酶，其可水解多种蛋白质分子的肽链生成多肽或氨基酸；又如菠萝蛋白酶，其能分解多种蛋白质以及肽、脂和酰胺等。本专利技术所述的特异性蛋白酶指的是底物特异性相对严格、仅能作用于蛋白质分子中某些特定肽键的一类蛋白酶，如羧肽酶催化水解含羧基的末端氨基酸所形成的肽键等。在本专利技术具体方案中，所述非特异性蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种，所述特异性蛋白酶选自羧肽酶、风味蛋白酶中的一种或两种；特别是，所述非特异性蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶中的两种或两种以上。本专利技术先采用特异性蛋白酶对玉米黄粉进行酶解，然后采用非特异性蛋白酶对酶解产物进一步进行酶解，两者配合使用能够达到较高的酶解效率，并且酶解液中的活性肽、特别是小分子量的活性肽的含量高。进一步地，所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～6000单位，其中包括0～1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500～2000单位酶量的碱性蛋白酶、500～2000单位酶量的中性蛋白酶和0～1500单位酶量的菠萝蛋白酶中的两种或多种；所述特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～3000单位，其中包括500～2000单位酶量的羧肽酶和1000～2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种。在本专利技术中，各蛋白酶的酶活力单位定义为：在试验条件下，每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位；并且所述每克蛋白中的蛋白具体指的是玉米黄粉中的蛋白，即玉米黄粉中每含有1克蛋白时加入相应单位酶量的各蛋白酶。采用本专利技术所述非特异性蛋白酶和特异性蛋白酶对玉米黄粉进行酶解，可以产生多种分子量小于1000道尔顿的低聚肽，本领域技术人员可以根据现有技术中的常规技术手段从酶解液中分离纯化出所述低聚肽，例如离心、微滤、超滤等。在本专利技术具体方案中，所述分离纯化包括离心、微滤、阳离子交换、纳滤和超滤中的一种或多种；特别是，本专利技术所述分离纯化具体为：对酶解液依次进行离心、微滤、阳离子交换、纳滤和超滤，其中所述微滤采用孔径为50～500nm的滤膜进行，所述纳滤采用截留分子量为100～300道尔顿的滤膜进行，所述超滤采用截留分子量为5000～13000道尔顿的滤膜进行。本专利技术还提供上述玉米活性肽添加剂在细胞无血清培养上的应用。进一步地，所述细胞包括CHO细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、BHK-21细胞、MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。本专利技术还提供上述玉米活性肽添加剂在促进细胞增殖、提高细胞活力和/或增强细胞产物表达上的应用。进一步地，所述细胞选自CHO细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、BHK-21细胞、MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。本专利技术还提供一种无血清培养基，包括上述任一所述的玉米活性肽添加剂，所述玉米活性肽添加剂在所述无血清培养基中的浓度为0.01～20g/L，优选为1～10g/L，进一步优选为2～4g/L。本专利技术还提供上述任一所述的玉米活性肽添加剂的制备方法，包括如下步骤：1）首先采用非特异性蛋白酶对玉米黄粉进行第一酶解处理，制得第一酶解液；然后采用特异性蛋白酶对所述第一酶解液进行第二酶解处理，制得玉米蛋白酶解液；2）将所述玉米蛋白酶解液进行离心，依次对离心上清液进行微滤、阳离子交换、纳滤和超滤，制得玉米活性肽；其中所述微滤采用孔径为50～500nm的滤膜进行，所述纳滤采用截留分子量为100～300道尔顿的滤膜进行，所述超滤采用截留分子量为5000～13000道尔顿的滤膜进行。根据本专利技术所提供的制备方法，所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～6000单位，其中包括0～1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500～2000单位酶量的碱性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于细胞培养基的玉米活性肽添加剂，其特征在于，所述玉米活性肽添加剂中分子量小于1000道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比≥90%，并且所述低聚肽至少包括AP、SAP、PAL、VNAP、PSSQ、TQPGPQ中的一种或多种。

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞培养基的玉米活性肽添加剂，其特征在于，所述玉米活性肽添加剂中分子量小于1000道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比≥90％，并且所述低聚肽至少包括AP、SAP、PAL、VNAP、PSSQ、TQPGPQ；所述玉米活性肽添加剂是通过依次采用非特异性蛋白酶和特异性蛋白酶对玉米黄粉进行酶解后，经分离纯化制得的；所述非特异性蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种，所述特异性蛋白酶选自羧肽酶、风味蛋白酶中的一种或两种；所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～6000单位，其中包括0～1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500～2000单位酶量的碱性蛋白酶、500～2000单位酶量的中性蛋白酶和0～1500单位酶量的菠萝蛋白酶中的至少两种；所述特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～3000单位，其中包括500～2000单位酶量的羧肽酶和1000～2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种；所述玉米活性肽添加剂中内毒素的含量<200EU/g；所述玉米活性肽添加剂的制备方法，包括如下步骤：1)首先采用非特异性蛋白酶对玉米黄粉进行第一酶解处理，制得第一酶解液；然后采用特异性蛋白酶对所述第一酶解液进行第二酶解处理，制得玉米蛋白酶解液；所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～6000单位，其中包括0～1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500～2000单位酶量的碱性蛋白酶、500～2000单位酶量的中性蛋白酶和0～1500单位酶量的菠萝蛋白酶中的至少两种；所述特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～3000单位，其中包括500～2000单位酶量的羧肽酶和1000～2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种；2)将所述玉米蛋白酶解液进行离心，依次对离心上清液进行微滤、阳离子交换、纳滤和超滤，制得玉米活性肽；其中所述微滤采用孔径为50～500nm的滤膜进行，所述纳滤采用截留分子量为100～300道尔...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡木易，林峰，刘艳，张海欣，谷瑞增，鲁军，魏颖，
申请(专利权)人：中国食品发酵工业研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11