本发明专利技术提供了一种犬原代细支气管上皮细胞及其在制备永生化细胞中的应用，属于生物技术领域。所述犬原代细支气管上皮细胞，取至45日龄的清洁级雄性比格犬。分离犬气管组织，剪碎后加入胶原酶及胰酶消化，得到完整的细支气管组织后培养所获细胞进一步通过间接免疫荧光试验检测角蛋白18表达，证实成功获得犬原代细支气管上皮细胞。构建含端粒酶基因（hTERT）的真核表达载体pEGFP-hTERT，转染犬原代细支气管上皮细胞后，hTERT基因高表达，细支气管上皮细胞能够稳定传代培养至少20代。本发明专利技术制备的犬永生化细支气管上皮细胞，为研究犬流感病毒等犬类病原的感染机制提供了重要的生物材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物
技术介绍
随着人类文明程度的提高，伴侣动物如犬的疾病研宄早已成为兽医学研宄的一个重点。对犬而言，传染性疾病多发于消化道和呼吸道，而呼吸道疾病是一年四季的常发病，对犬的危害最大。目前多种病毒和细菌等微生物被认为是引起犬呼吸系统疾病的病原，如2004年爆发随后陆续报道的犬流感病毒。然而，相较于畜禽病原，犬类病原研宄比较薄弱，特别是这些病原对犬呼吸系统疾病的发生起着怎样的作用，致病机理如何，尚不清楚。气道上皮是气道与外界环境接触的第一道防线，不仅是各种病原体、炎症介质作用的靶细胞，还作为效应细胞合成、释放多种炎性介质和细胞因子，从而参与气道炎症及免疫反应。在研宄人类以及畜禽呼吸道病原感染的致病机理方面，支气管上皮细胞等已被广泛用作细胞模型，然而目前，对于犬类病原的研宄还缺乏合适的细胞模型。犬流感病毒是近年来新发现的犬类病原。有研宄表明，犬感染犬流感病毒后会发生严重的气管支气管炎，受体结合试验表明犬流感病毒在犬的支气管和细支气管上皮细胞中大量发现，而在气管上皮细胞中鲜有发现。同时感染犬的病理组织学检查显示，病变在下呼吸道即细支气管和肺泡尤为严重，而在上呼吸道即气管和支气管病变则相对温和，说明细支气管上皮细胞的获得将对研宄犬流感病毒的致病机理具有相当大的价值。由于细支气管上皮细胞在体外培养难以长期传代生存，因此制备永生化的犬细支气管上皮细胞具有重要意义。细胞永生化是指细胞经体外培养后自发或受外界因素的影响脱离增殖衰老的危机，最终获得无限增殖能力的过程。永生化自发生的几率极低，因此通过导入外源基因的方法，使细胞永生化几率得以提高，进而获得永生化的细胞系。一般5代左右的细胞称为原代细胞，超过20代的细胞可以称为永生化细胞系。永生化细胞的检测主要包括通过光学和电子显微镜与原代细胞进行形态学鉴定比较以及细胞表面抗原的检测。目前在细胞的永生化上应用最多的是SV40大T抗原，但由于其永生化的细胞有致癌性，会改变原代细胞原有特性，因而用此种方法得到的永生化细胞研宄病毒感染细胞的致病机理不合适。端粒是真核细胞染色体末端的特殊DNA蛋白质结构，由一简单重复的富含碱基鸟嘌呤G的高度保守的DNA序列及相关蛋白质组成。随着细胞分裂时染色体DNA复制的进行，端粒逐渐缩短，每次复制，由于“末端复制问题”的发生，DNA 5’端大概丢失50bp?200bp。由于其长度能够反映出细胞的复制史和复制潜能，从而被称为是细胞寿命的“有丝分裂钟” 。端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖核蛋白酶，也是一种专一的逆转录酶，由RNA和蛋白质组成。能够以自身RNA为模板，从端粒DNA 3’ -OH末端延伸或合成新的端粒DNA，从而补偿细胞分裂造成的染色体末端的缩短，使细胞不会在端粒耗尽时出现凋亡。端粒酶是一种逆转录酶，其主要作用是与自身携带的RNA模板合成端粒重复DNA序列，并加到端粒末端而维持端粒的长度，以抵消或延缓端粒随细胞分裂的不断缩短。端粒酶不但可以保持染色体完整，还是细胞生存期限的关键性调控因子，同时还可以提高细胞对毒性因子和应激原等的耐受能力，在细胞的永生化进程中起重要作用。目前研宄比较透彻的人类的端粒酶是由端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白以及端粒酶逆转录酶组成的。在原代培养的细胞中，转入外源性的hTERT基因能够诱导端粒酶活性，稳定端粒的长度，从而使细胞寿命延长或永生化。hTERT能激活端粒酶，因此可能是新生和永生化细胞端粒酶的活化过程中的一个主要因素。到目前为止，通过转染hTERT基因已建立了许多永生化的细胞系，如Georg1s等在2005年将hTERT基因转染鸡胚成纤维细胞，2009年吴庆侠等导入外源hTERT进山羊子宫内膜上皮细胞等。本专利技术通过脂质体转染端粒酶基因获得永生化的犬细支气管上皮细胞，为研宄犬流感病毒等犬类病原的感染机制提供了重要的生物材料。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于制备犬原代细支气管上皮细胞，通过转染端粒酶基因制备永生化的犬细支气管上皮细胞，使其稳定传代至20代以上，为研宄犬流感病毒等犬类病原的感染机制提供了重要的生物材料。技术方案一种犬原代细支气管上皮细胞，该细胞株CBEl于2014年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC:C2014223，分类命名:犬原代细支气管上皮细胞。所述的犬原代细支气管上皮细胞通过转染端粒酶真核表达载体获得永生化的犬细支气管上皮细胞。其特征在于:I)真核表达载体重组质粒pEGFP-hTERT的构建按照质粒DNA小提中量纯化试剂盒步骤提取质粒PC1-neo-hTERT，经质量比I %琼脂糖凝胶电泳检测鉴定正确后用EcoR I和Sal I双酶切重组质粒，利用小量胶回收试剂盒纯化回收3.5kb的片段，即为hTERT ；用EcoR I和Sal I双酶切荧光真核表达载体pIRES2_EGFP，酶切片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，与hTERT按摩尔比4:1的比例加入目的片段和载体，然后加入I yL T4DNA Ligase，配制10 μ L连接体系，混匀后于PCR仪16°C过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，卡那霉素抗性筛当前第1页1 2 3 4 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种犬原代细支气管上皮细胞，该细胞株CBE1于2014年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC：C2014223，分类命名：犬原代细支气管上皮细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永杰，谢星，庞茂达，郁磊，林焱，赵艳兵，梁姗，马可，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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