本发明专利技术涉及一种具有抗肿瘤活性的茯苓菌丝体胞外多糖的制备方法，采用野生茯苓菌种在ｐＨ值为５．０～６．０的玉米浆培养基中用经高压灭菌的发酵罐进行茯苓菌丝体深层发酵；收聚培养液；采用喷雾干燥机干燥得到胞外粗多糖；用蒸馏水将胞外粗多糖溶解，过滤后用Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］脱色，用Ｓｅｖａｇ法除去游离的蛋白质，然后分别用清水和二次蒸馏水透析５～７天和３～５天，减压蒸馏，冷冻干燥得纯胞外多糖。体内活性实验表明，这种水溶性杂多糖对植入小鼠体内的Ｓａｒｃｏｍａ１８０肿瘤的生长具有明显的抑制作用，而且无毒副作用。体外活性实验表明，该类多糖对人体急性白血病毒细胞（ＨＬ－６０）的增殖有显著的抑制效果，而且不会破坏正常猴肾细胞的生长。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及具有抗肿瘤活性的茯苓菌丝体胞外多糖的制备方法。它属于高分子化学领域，也属于分子生物学领域。
技术介绍
80年代以来的研究表明，真菌多糖对多种危害人类健康的疾病，如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、肺炎等都具有显著的疗效。多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬功能，诱导产生肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞素，从而提高人体的免疫机能，而且对正常细胞没有毒副作用(Intern.J.Orient.Med.17，57，1992)。茯苓长期用于中药配方，在传统医学上用作灵丹妙药。从茯苓菌核和菌丝体中碱提取的多糖具有明显的抗肿瘤活性(Carbohydr.Res.87，161，1980；Yakugaku Zasshi，106，307，1986)。我们已用实验室摇床培养了茯苓菌丝体，并得到三种水溶性多糖，它们具有抗肿瘤活性(Carbohydr.Res.338，1507，2003；Carbohydr.Res.338，1517，2003)然而实验室摇床培养不仅菌丝体产量很少，而且全部用手工，费时且繁杂。采用液体深层发酵(Submergedfermentation)技术通过中试自动化装置和程序获得菌丝体可克服这些缺点。另外通过培养茯苓菌丝体，并分离出具有抗肿瘤活性的成分，同时弄清它们的一级和二级结构以及生物活性尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供，该方法简单易行、成本较低廉，产率较高。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下，采用华中农业大学提供的野生茯苓菌种wolf Poria cocos(编号P0)在pH值为5.0～6.0的玉米浆培养基中用经高压灭菌的发酵罐进行茯苓菌丝体深层发酵；培养温度25～30℃，罐内压力0.7～0.9Mpa，空气流量为发酵罐体积的0.5～1倍/分钟，搅拌速度120～200rpm；发酵48～72小时，然后空气流量加大到发酵罐体积的1～1.5倍/分钟；总共发酵7～10天，收集培养液；采用喷雾干燥机干燥得到胞外粗多糖，干燥机的入口温度250℃，出口温度70～80℃；用蒸馏水将胞外粗多糖溶解，过滤后用20～30wt％H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质，反复进行9～12次，然后分别用清水和二次蒸馏水透析5～7天和3～5天，减压蒸馏，冷冻干燥得纯胞外多糖(Pi-PCM0)。上述培养基的基本组成为玉米浆5～15mL、D-葡萄糖20～30g、酵母膏3～3.5g、KH2PO40.8～1.2g、CaCl2·2H2O 0.04～0.08g、MnCl2·4H2O 3～7mg、MgSO4·7H2O 0.3～0.7g、ZnCl22～6mg、Fe2(SO4)33～7mg、维生素B10.08～0.12mg、蒸馏水1L。上述水溶性胞外多糖用酚磺酸法测定多糖中碳水化合物的含量，用红外、气相色谱、粘度计及光散射仪确定了其化学组成和二级结构。上述水溶性胞外多糖的单糖组成主要由α-D-葡萄糖、甘露糖、半乳糖组成，其重均分子量为7.7×104。本专利技术简单易行、成本较低廉，产率较高。本专利技术培养的茯苓菌丝体多糖Pi-PCM0在小鼠体内对Sarcoma180肿瘤表现出较高的抗肿瘤活性。由此表明，本专利技术采用喷雾高温干燥并未影响胞外多糖的抗肿瘤活性。体外活性实验也表明，该类多糖对人体急性白血病毒细胞(HL-60)的增殖有显著的抑制效果，而不会破坏正常猴肾细胞的增殖。因此，该多糖可用于制备抗肿瘤药物和提高机体免疫功能的保健品，具有极大的推广和应用前景。具体实施例方式以下结合具体的实例对本专利技术的技术方案作进一步说明实施例茯苓菌种为华中农业大学应用真菌研究所从湖北罗田野生茯苓菌核分离出的野生茯苓菌种(编号P0；公众可随时购买)。液体培养基配方如下玉米浆(10mL)，D-葡萄糖(25g)，酵母膏(3.2g)，KH2PO4(1.0g)，CaCl2·2H2O(0.06g)，MnCl2·4H2O(5mg)，MgSO4·7H2O(0.5g)，ZnCl2(4mg)，Fe2(SO4)3(5mg)，维生素B1(0.1mg)，蒸馏水(1L)。首先在斜面培养基中培养菌种。培养用的试管以及棉塞先在121℃消毒灭菌30分钟(空消)，再装入培养基在121℃消毒灭菌30分钟，斜放冷却使其凝固成斜面。然后在无菌室接种。斜面培养在恒温28℃下进行，为期7天得到茯苓菌种。将40L上述液体培养基(pH＝5.5)倒入50升经120-150℃蒸汽灭菌的发酵罐设备，然后将上述斜面培养基中培养的菌种接入发酵罐设备(中船总公司七一九研究所一九零工厂(武汉)设计制造)进行茯苓菌丝体深层发酵。培养温度28℃，罐内压力0.8Mpa，空气流量2m3/h，搅拌速度150rpm。两天后空气流量加大到3m3/h。培养7天。共生产出茯苓菌丝体约300g(干重)，产率为7.5g/L，比实验室摇床培养的菌丝体产率高56.25％(摇床培养产率4.8g/L)。所得茯苓菌丝体培养液外观澄清透明，浅棕黄色，略带清香气味。终止发酵时，培养液pH值为3，较开始时(pH＝5.5)有所降低。菌丝体为浅黄色，且有一种淡香味。40升茯苓菌丝体培养液用PSD52型喷雾干燥机(丹麦APV安海达诺公司)干燥得到51.8g胞外粗多糖，喷雾干燥机的入口温度250℃，出口温度70～80℃。用蒸馏水将胞外粗多糖溶解，过滤后用30％H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质，反复进行9次以上直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后分别用清水和二次蒸馏水透析5天和3天，浓缩，最后冷冻干燥得5.2克胞外多糖(Pi-PCM0)。所得多糖为白色粉状固体。多糖Pi-PCM0的组成、碳水化合物含量、分子量列于附表1。它们对植入Sarcoma180肿瘤的小鼠进行体内腹腔注射试验列于附表2。对人体急性白血病毒细胞(HL-60)的抗增殖试验的生物活性结果示于附表3。由此表明这种茯苓菌丝体胞外多糖具有明显抗肿瘤活性以及对人体急性白血病毒细胞增殖的抑制作用。附表1.茯苓菌丝体水溶性胞外多糖单糖组成、碳水化合物含量和分子量多糖中单糖含量(％)样品 碳水化合物 Mw×10-4岩藻糖阿拉伯糖木糖甘露糖 半乳糖葡萄糖含量(％) (gmol-1)Pi-PCM0 - 2.5 1.5 70.6 18.5 7.0 82.6 7.7-未检测到附表2.茯苓菌丝体水溶性胞外多糖抗Sarcoma180肿瘤活性剂量样品 抑制率(％)完全抑制(mg/kg×days)Pi-PCM020×1042.1 0/8注生物活性试验在香港中文大学生物系进行附表3.茯苓菌丝体水溶性胞外多糖对人体急性白血病毒细胞(HL-60)增殖的抑制作用样品 200μg/mL 100μg/mL 50μg/mLPi-PCM0 81.03％68.08％57.56％注生物活性试验在香港中文大学生物系进行权利要求1.，其特征在于采用华中农业大学提供的野生茯苓菌种wolf Poria cocos在pH值为5.0～6.0的玉米浆培养基中用经高压灭菌的发酵罐进行茯苓菌丝体深层发酵；培养温度25～30℃，罐内压力0.7～0.9Mpa，空气流量为发酵罐体积的0.5～1倍/分钟，搅拌速度120～200rpm；发酵48～72小时，然后空气流量加大到本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有抗肿瘤活性的茯苓菌丝体胞外多糖的制备方法，其特征在于：采用华中农业大学提供的野生茯苓菌种ｗｏｌｆＰｏｒｉａｃｏｃｏｓ在ｐＨ值为５．０～６．０的玉米浆培养基中用经高压灭菌的发酵罐进行茯苓菌丝体深层发酵；培养温度２５～３０℃，罐 内压力０．７～０．９Ｍｐａ，空气流量为发酵罐体积的０．５～１倍／分钟，搅拌速度１２０～２００ｒｐｍ；发酵４８～７２小时，然后空气流量加大到发酵罐体积的１～１．５倍／分钟；总共发酵７～１０天，收集培养液；采用喷雾干燥机干燥得到胞外粗多糖，干燥机的入口温度２５０℃，出口温度７０～８０℃；用蒸馏水将胞外粗多糖溶解，过滤后用２０～３０ｗｔ％Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］脱色，用Ｓｅｖａｇ法除去游离的蛋白质，反复进行９～１２次，然后分别用清水和二次蒸馏水透析５～７天和３～５天，减压蒸馏，冷冻干燥得纯胞外多糖。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张俐娜，金勇，陈莉，陈立国，张志强，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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