猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型的构建方法，该法设置细胞对照组和PCV2病毒感染组，加入RPMI 1640培养液及相应浓度病毒液，与细胞吸附2h后弃液，加入1mL含5％FBS的RPMI 1640培养液后继续培养，分别收样，用于细胞活性及与细胞氧化还原状态相关指标的测定。该模型具有构建方便、成本较低、实用性强等特点，它为研究PCV2感染是否能引起免疫细胞氧化还原状态的改变及其作用机制提供了较理想的体外模型，进而将有可能为PCV2感染引起的动物疾病的治疗提供一些新思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于巨噬细胞氧化应激模型
，尤其涉及一种猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型的构建方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(PCV2)感染引发的猪圆环病毒病已成为影响全球养猪业的重大疾病，带来了巨大的经济损失。PCV2病毒复制的主要场所是机体的单核-巨噬细胞和抗原提呈细胞，PCV2感染后，病猪体内肺、肝、肾、扁桃体、胸腺、外周血单核细胞、支气管淋巴结、腹股沟淋巴结中均能检测到PCV2病毒核酸，PCV2感染的主要表现为淋巴细胞缺失和单核细胞浸润等。因此引起猪免疫系统的破坏，免疫能力受到抑制。PCV2增殖的主要场所是B淋巴细胞，B淋巴细胞也在PCV2感染后诱导了淋巴细胞的凋亡，引起免疫抑制。巨噬细胞的吞噬作用是机体清除外来微生物入侵并参与炎症反应的一个免疫应答过程，猪肺泡巨噬细胞(Porcinealveolarmacrophages，PAM)和其它单核吞噬细胞能抵抗各种病原体的感染，在机体免疫功能中扮演重要作用。PCV2感染后，猪肺泡巨噬细胞作为PCV2的靶细胞，是首先抵御肺部损伤的重要免疫细胞。PCV2感染猪肺泡巨噬细胞的程度也是病猪的肺部损伤程度的一个重要参考。然而，关于PCV2感染是否能引起免疫细胞氧化还原状态的改变还缺乏认识，亟待进一步研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种构建方便、成本较低、实用性强的猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型的构建方法，为研究PCV2感染是否能引起免疫细胞氧化还原状态的改变及其作用机制提供较理想的体外模型。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型的构建方法，采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞，病毒滴度为104TCID50/0.1mL，感染时间为4-24h。感染剂量为1mLPCV2病毒液。上述猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型的构建方法，于包括以下步骤：(1)3D4/2细胞经复苏传代后，调整细胞浓度为5×106cell/mL备用；(2)设置细胞对照组和PCV2病毒感染组，加入RPMI1640培养液及相应浓度病毒液，与细胞吸附2h后弃液，加入1mL含5％FBS的RPMI1640培养液后继续培养，分别收样；(3)收样用于细胞活性及与细胞氧化还原状态相关指标的测定。复苏传代后活细胞数＞95％。PCV2病毒感染组分为5个不同浓度，分别是100、10-1、10-2、10-3、10-4PCV2。收样时间分别为第4h、8h、12h、24h、48h。细胞氧化还原状态相关指标为细胞活性、细胞NO分泌水平、ROS水平、T-GSH、GSH、GSSG含量及XOD、MPO、iNOS活性。专利技术人利用猪肺泡巨噬细胞(3D4/2细胞)设计并建立了一种猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型的构建方法，该法设置细胞对照组和PCV2病毒感染组，加入RPMI1640培养液及相应浓度病毒液，与细胞吸附2h后弃液，加入1mL含5％FBS的RPMI1640培养液后继续培养，分别收样，用于细胞活性及与细胞氧化还原状态相关指标的测定。本专利技术系首次使用猪圆环病毒2型(PCV2)作为诱因建立猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型，并首次使用NO分泌水平、ROS水平、T-GSH、GSH、GSSG含量等指标作为氧化应激的相关评价指标。该模型具有构建方便、成本较低、实用性强等特点，它为研究PCV2感染是否能引起免疫细胞氧化还原状态的改变及其作用机制提供了较理想的体外模型，进而将有可能为PCV2感染引起的动物疾病的治疗提供一些新思路。按照本专利技术的培养条件和方法，能够帮助初次进行PCV2猪肺泡巨噬细胞氧化应激研究的人员较顺利的建立猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型。应用本专利技术，专利技术人还确定了PCV2的最佳感染浓度和孵育时间及猪肺泡巨噬细胞氧化应激最适孵育时间。附图说明图1是PCV2感染对3D4/2细胞存活率的变化图。图2是PCV2感染3D4/2细胞对NO分泌的变化图。图3是PCV2感染3D4/2细胞对ROS水平的变化图。图4是PCV2感染3D4/2细胞对细胞内GSH的变化图。图5是PCV2感染3D4/2细胞对细胞内GSSG的变化图。图6是PCV2感染3D4/2细胞对细胞内GSH/GSSG的变化图。图7是PCV2感染3D4/2细胞对细胞XOD活性的变化图。图8是PCV2感染3D4/2细胞对细胞MPO活性的变化图。图9是PCV2感染3D4/2细胞对细胞iNOS活性的变化图。图2、图3、图7、图8和图9中：时间轴上同一时间点对应的各柱状图从左到右分别为细胞对照组，PCV2稀释1000倍，PCV2稀释100倍，PCV2稀释10倍，PCV2原液。图4、图5和图6中：时间轴上同一时间点对应的各柱状图从左到右分别为细胞对照组，PCV2稀释10000倍，PCV2稀释1000倍，PCV2稀释100倍，PCV2稀释10倍，PCV2原液。具体实施方式一、研究思路通过PCV2感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2细胞)，测定病毒感染后细胞分泌一氧化氮(NO)的水平、细胞内总活性氧(ROS)水平、还原型谷胱甘肽(GSH)含量、黄嘌呤氧化酶(XOD)活性、髓过氧化物酶(MPO)活性、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)活性，探讨PCV2病毒感染量、感染时间与活性氧水平动态变化的相关性，并建立猪肺泡巨噬细胞氧化应激体外模型。二、实验方法(1)3D4/2细胞的培养：3D4/2细胞复苏后用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液转入瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞长至70％-80％时进行传代，传代时用0.05％胰酶消化后以1∶3的比例进行传代培养，待细胞达到一定数量后，台盼蓝拒染法计数活细胞数＞95％，调整细胞浓度为5×106cell/mL备用。(2)分别设置细胞对照组和5个不同浓度PCV2病毒感染组(100、10-1、10-2、10-3、10-4)，每组4个重复，按1000μL/孔加至24孔板内，培养过夜使细胞贴壁后弃去培养液，PBS缓冲液洗3次，细胞对照组加入无血清RPMI1640培养液200μL，病毒组加入等量不含血清的RPMI1640培养液稀释的不同浓度病毒液，37℃，5％CO2培养箱中吸附2小时，弃去病毒液，PBS缓冲液清洗3次后每孔加入1mL含5％FBS的RPMI1640培养液后继续培养，分别于第4、8、12、24、48h收样，用于后续指标测定。(3)细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型的构建方法，其特征在于：采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞，病毒滴度为104TCID50/0.1mL，感染时间为4‑24h。

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型的构建方法，其特征在于：
采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞，病毒滴度为104TCID50/0.1mL，感染时
间为4-24h。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型的构建
方法，其特征在于：所述感染剂量为1mLPCV2病毒液。
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激模型的构建
方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)3D4/2细胞经复苏传代后，调整细胞浓度为5×106cell/mL备用；
(2)设置细胞对照组和PCV2病毒感染组，加入RPMI1640培养液及相应浓度病毒液，与
细胞吸附2h后弃液，加入1mL含5％FBS的RPMI1640培养液后继续培养，分别收样；
(3)收样用于细胞活性及与细胞氧化还原状态相...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡庭俊，尹丹，谭红连，韦英益，郝祝兵，杨剑，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45