本发明专利技术属于单克隆抗体领域，涉及针对CCL18(趋化因子配体18)功能受体PITPNM3的单克隆抗体，以及该单克隆抗体的用途。本发明专利技术所述的一种单克隆抗体，能特异性地识别趋化因子配体18功能受体PITPNM3，是由保藏号为CCTCC NO:C2014190的PITPNM3mAb杂交瘤细胞株所分泌的。本发明专利技术还提供了将所述的单克隆抗体用于制备抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导乳腺癌细胞转移的药物的用途。本发明专利技术所述的针对PITPNM3的单克隆抗体能在体内外模型中明显抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导乳腺癌细胞的转移。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于单克隆抗体领域，涉及针对CCL18(趋化因子配体18)功能受体 PITPNM3的单克隆抗体，以及该单克隆抗体的用途。
技术介绍
巨噬细胞是肿瘤微环境中最为重要的免疫细胞，巨噬细胞在不同的环境条件下会 表现出不同的表型从而对肿瘤表现出截然不同的作用。而肿瘤相关巨噬细胞是由巨噬细胞 在肿瘤微环境中诱导产生的。肿瘤相关巨噬细胞能促进肿瘤的迀移、转移和进展。而在针 对肿瘤的治疗方案中，抗体靶向性治疗已逐渐发展成为恶性肿瘤治疗的重要组成部分。单 克隆抗体作为特异强、靶向性好的药物在临床上具有非常高的应用价值和意义。然而单克 隆抗体在临床治疗应用中的研宄和进展却是相对滞后，因此有必要开发针对肿瘤微环境作 用的单克隆抗体。 在前期研宄中，专利技术人从人乳腺癌标本分离出肿瘤相关巨噬细胞，通过分析其细 胞因子表达谱，发现CCL18 (趋化因子配体18)是乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞分泌最多的细胞 因子。体内外实验证实，CCL18除了直接促进肿瘤细胞与细胞外基质的粘附，诱导肿瘤细胞 发生上皮间质转化，从而促进肿瘤细胞转移，还诱导血管形成、募集幼稚T淋巴细胞将其诱 导为免疫抑制Treg、诱导正常成纤维细胞分化为促肿瘤表型（Chen J*，Yao Y*，Gong Ο, Yu F*, Sun S, Chen J, Liu B, Deng H, Wang F, Lin L, Yao H, Sun F, Karen S. Anderson, Liu Q, Mark E. Ewen, Yao X#, Song E#. CCL18from Tumor-Associated Macrophages Promotes Breast Cancer Metastasis via PITPNM3. Cancer Cell. 2011，19(4) :541 - 555.) 〇 专利技术人通过与CCL18免疫共沉淀和质谱分析锁定肿瘤细胞膜蛋白PITPNM3。CCL18 和PITP匪3特异性结合在乳腺癌细胞的细胞膜表面。接着，专利技术人发现在乳腺癌细胞和幼 稚淋巴细胞中敲低PITP匪3能抑制CCL18介导的信号通路激活和趋化运动。最后，专利技术人 在稳定转染PITPW3的HEK293细胞中通过多种公认鉴定细胞因子受体的方法证明PITPW3 是CCL18的功能受体。因此，有必要开发针对PITPNM3的单克隆抗体，可能为肿瘤细胞和间 质细胞的靶向治疗提供新思路。
技术实现思路
本专利技术提供一种针对PITP匪3的单克隆抗体，它能在体内外模型中明显抑制肿瘤 相关巨噬细胞诱导乳腺癌细胞的转移。 本专利技术所述的一种单克隆抗体，能特异性地识别趋化因子配体18功能受体 PITP匪3,是由保藏号为CCTCC N0:C2014190的PITP匪3mAb杂交瘤细胞株所分泌的。该杂 交瘤细胞株保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址是中国湖北省武汉市武汉 大学，保藏日期为2014年10月22日。 本专利技术还提供了所述的针对PITP匪3的单克隆抗体的用途。 本专利技术所述的用途是将所述的单克隆抗体用于制备抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导 乳腺癌细胞转移的药物的用途。 专利技术人通过专业软件分析挑选出16个抗原表位，然后针对这16个抗原表位研制 出16个针对不同抗原表位的PITP匪3单克隆抗体。经过反复筛选验证，专利技术人发现其中 一个针对PITPW3胞外段的单克隆抗体，在共培养体系中加入PITPW3单克隆抗体能明显 抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导肿瘤细胞的EMT、迀移和侵袭。在进一步的体内试验中，专利技术 人验证了 PITP匪3单克隆抗体的药效，通过建立人源化小鼠技术（I. Shicheng Su, Qiang Liuj Jingqi Chen，Jianing Chen，Fei Chen, Chonghua He, Di Huang, Wei Wuj Ling Linj Wei Huang, Jin Zhang, Xiuying Cuij Fang Zheng, Haiyan Li, Herui Yaoj Fengxi Suj Erwei Song. A positive feedback loop between mesenchymal-Iike cancer cells and macrophages is essential to breast cancer metastasis. Cancer Cell. 2014, 25, I -16.)的巨噬细胞促进肿瘤细胞的肝肺转移模型，即注射PITP匪3单克隆抗体后，发现其能 明显抑制巨噬细胞促进肿瘤细胞的肝肺转移及延长荷瘤小鼠的生存期。【附图说明】 图1显示体外插入孔实验检测PITP匪3单克隆抗体抑制乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231 迀移的结果。 图2显示细胞迀移计数结果，发现有三个抗体有较为明显中和功能，其中一个抗 体中和效果达到约70% (箭头所指）。 图3显示PITP匪3单克隆抗体能抑制肿瘤相关巨噬细胞分泌的CCL18所引 起的乳腺肿瘤细胞的上皮间质转化。上排为相差显微镜。图中，下排为DAPI (蓝色）， E-cadherin (红色），vimentin (绿色）的免疫焚光。 图4显示PITP匪3单克隆抗体能抑制肿瘤相关巨噬细胞分泌的CCL18所引起的乳 腺肿瘤细胞的侵袭与迀移。 图5显示PITP匪3单克隆抗体对肿瘤细胞的迀移能力和侵袭能力的影响。 图6显示PITP匪3单克隆抗体抑制小鼠肝肺转移情况。 图7显示PITP匪3单克隆抗体能延长荷瘤小鼠生存期情况。【具体实施方式】 实施例一：针对PITPNM3的单克隆抗体的制备 专利技术人所在的研宄团队利用上海Abmart公司独有的SEAL抗原设计技术对 PITP匪3氨基酸全序列进行分析，并进行综合评分，挑选16个10肽作为抗原（表一）。 表一：从PITP匪3氨基酸序列得到的16个抗原序列及其起止氨基酸残基位置 通过化学合成的方法合成上述16条10肽抗原的核苷酸序列并连上T载体 (TAKARA)，并在抗性琼脂平板上进行蓝白斑筛选挑选阳性克隆，经菌落PCR鉴定并测序验 证后将该阳性克隆小转入小规模培养后抽提质粒进行双酶切，将目标片段进行切胶回收并 连上真核表达载体pcDNA3.1(购买自Invitrogen)，转化大肠杆菌（E.coli)后扩增表达质 粒，中量抽提表达质粒，经纯化后转染HEK293细胞（购买自美国ATCC)。大规模培养并收集 HEK293细胞，经静脉注射注入小鼠外周血中，经过初次基础免疫及加强免疫后，杀死小鼠并 获取小鼠脾脏，碾碎制成单细胞悬液，过滤并离心祛除杂质后收集较纯的脾细胞，加入完全 培养基进行培养。 培养骨髓瘤细胞株SP2/0(购自美国典型生物保藏中心ATCC，http://www. atcc. org/products/all/CRL-8287. aspx)，并维持其最佳生长状态，使其在细胞融合时处于对数 生长期。将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，根据常规方法制成杂交瘤细胞株。 大规模培养杂交瘤细胞株，通过有限稀释法对杂交瘤细胞株进行克隆化，从而获 取稳定分泌抗体的纯系杂交瘤细胞株。将常规培养的杂交瘤细胞用胰酶消化并计数，将杂 交瘤细胞稀释后的悬液种入96孔本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单克隆抗体，能特异性地识别趋化因子配体18功能受体PITPNM3，是由保藏号为CCTCC NO:C2014190的PITPNM3mAb杂交瘤细胞株所分泌的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋尔卫，何重华，苏士成，刘强，刘玉洁，曾韵洁，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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