一种基于3D温敏型生物凝胶悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞的方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体是一种基于3D温敏型生物凝胶悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞的方法，可用于检测肝癌患者外周血中肿瘤细胞数目、并由此判断预后。本发明专利技术还提供一种用于悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞的温敏型生物凝胶及其应用。本发明专利技术经实验证明，肝癌循环肿瘤细胞在本发明专利技术的温敏型生物凝胶体系中，可以进行扩增生长并形成显微镜下可见的克隆环，从而实现计数的可操作性。本发明专利技术为肝癌循环肿瘤细胞的诊断提供了新的临床手段。

Method for counting liver cancer circulating tumor cell in vitro based on 3D temperature sensitive biological gel hanging drop culture method

The present invention relates to the technical field of biological medicine, in particular to a method for 3D temperature sensitive bio gel based on the hanging drop culture method in vitro counting circulating tumor cells, tumor cell number, detection of peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma and the prognosis for. The invention also provides a temperature sensitive biological gel used for counting liver cancer circulating tumor cells in vitro by hanging drop culture method and uses thereof. The experiment proved that liver cancer circulating tumor cells in temperature sensitive biological gel system of the invention, can be amplified to grow and form under the microscope to clone ring visible, so as to realize the counting operation. The invention provides a new clinical means for the diagnosis of circulating tumor cells of liver cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种基于3D温敏型生物凝胶悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞的方法
本专利技术涉及生物医药
，具体地说，是一种基于3D温敏型生物凝胶悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞的方法。
技术介绍
肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是一种起源于肝细胞的恶性肿瘤，素有“癌中之王”的称号，其发病较其他肿瘤而言相对隐匿，病程短、治疗困难，严重威胁着人类的生命健康。据2016年《ACancerJournalforClinicians》杂志的统计数据显示：2015年中国境内共计281.4万人死于各种癌症，其中42.2万人死于肝癌，仅次于肺癌(61.0万)与胃癌(49.8万)，病死率居全国第3位。由于在肝癌的早期，患者多没有典型临床症状和体征，临床上难以发现，而一旦出现典型症状，多已是中、晚期肝癌，此时往往伴随着肝癌的肝内外转移，最终患者多因此死亡。肝癌患者较差的预后主要是由于肝内及肝外转移。而研究表明那些直径仅有0.5cm-1cm的肝癌瘤体(目前的影像学检查的极限)就已经开始向血道散播循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,CTC)，甚至在远端器官中形成微小的转移灶，成为肝癌恶性患者出现术后复发和远端转移的高危因子。因此检测肝癌患者体内是否具有CTC显得尤为迫切。CTC在外周血中数量稀少，其检测诊断存在一定的技术难度。目前检测方法分为两大类：1、不富集CTC，直接根据肿瘤标志物通过流式细胞术、PCR等手段进行检测；2、通过CTC表面标志物磁珠富集后，荧光染色后进行计数。目前这些检测手段都取得了一定的临床数据，其代表为强生公司的CellSearch系统，2004年美国食品和药品管理局(foodanddrugsadmistration,FDA)批准了该系统用于检测转移性乳腺癌患者外周血CTC，成为第一个获准进入临床运用的CTC检测方法。遗憾的是，目前现有的检测系统并不适用于肝癌CTC检测。以CellSearch系统为例，仪器分选所用的EpCAM靶点仅适用于上皮来源的CTC。但进一步研究表明，即使用于在上皮来源CTC检测，该系统所获得的数据也极不完善：美国MDAnderson和Baylor医学院的研究人员发现，在肿瘤CTC转移中会发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)，从而EpCAM及CK蛋白在CTC中发生降解从而无法被系统捕捉；过高的假阳性也限制了该系统应用于肿瘤筛查，有研究发现克罗恩病人中有11％-19％的患者会出现CK+/EpCAM+阳性信号，这些细胞实际是是肠上皮细胞而非肿瘤细胞；本专利技术对GEO数据库中样本量最大的一例肝癌数据芯片集进行分析(样本涵盖220例癌旁与225例癌组织)，结果显示EpCAM在肝癌中的阳性率低于30％。这些结果均提示现有的技术手段依然存在技术上的巨大漏洞，并不适用于肝癌CTC检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对目前肝癌CTC检测面临的临床问题，提供一种新型的肝癌循环肿瘤细胞的计数方案，具体是指一种基于3D温敏型生物凝胶悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞的方法，该方法在检测肝癌患者外周血中肿瘤细胞数目、并由此判断预后中的应用；本专利技术还提供了温敏型生物凝胶及其培养上清的制备方案与配方。本专利技术的第一方面，提供一种用于悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞的温敏型生物凝胶，由体积比为8:1:1的A液、B液和C液组成(混合时是将A液、B液和C液三种液体按比例逐一混合，并用无菌铂金棒搅拌均匀，全过程在冰上操作)；所述的A液，包括生物凝胶的骨架溶液和基质溶液，7mL骨架溶液与1mL基质溶液在冰上混合，并用无菌铂金棒搅拌均匀，4℃保存，即得A液；所述的生物凝胶的骨架溶液：使用亲水链聚氧乙烯占60％以上的泊洛沙姆，配置体积分数为20-45％的泊洛沙姆(Poloxamer)溶液；配置体积分数为0.2-0.7％的羟丁基壳聚糖溶液；两种液体在冰上冰浴15min后，将两者按体积比1：1充分混合，获得所述的生物凝胶的骨架溶液；所述的生物凝胶的基质溶液：将0.5-0.8mgIV型胶原、0.01-0.1mg分子量为10000-50000的透明质酸和0.01-0.1mg硫酸氨基葡糖多聚糖于1mL超纯水中4℃下过夜溶解，获得生物凝胶的基质溶液；所述的B液组分为10倍浓度的DM/F12培养基，每1mLB液中加入1000-5000IU的rh-EGF，作用为调节生物凝胶内的营养成分和离子浓度；所述的C液组分为pH＝2.5-3.0的乳酸-乳酸钠缓冲液(0.025-0.05mol)，作用为调节生物凝胶内的pH值。本专利技术的第二方面，提供上述的温敏型生物凝胶在悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞中的应用。本专利技术的第三方面，提供一种基于上述的3D温敏型生物凝胶悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：(a)取肝癌患者10mL外周血，Ficoll密度梯度离心法分离患者外周血有核细胞；(b)使用StemCellCD45阴选试剂盒去除白细胞，20μL磷酸盐缓冲液(PBS)重悬；(c)所述的温敏型生物凝胶的A液、B液和C液按比例逐一混合，并用无菌铂金棒搅拌均匀，加入细胞，全过程在冰上操作(具体为800μLA液在冰上先与100μLB液混合，无菌铂金棒搅拌均匀后，加入100μLC液，再次搅拌均匀，加入20μL细胞悬液，全过程在冰上操作)；(d)24孔培养板在37℃预热30min，细胞凝胶混合液50μL/滴加至预热培养板上，使凝胶迅速转化为果冻状；(e)37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育2h，加入37℃预热的培养上清1mL；(f)连续培养7天后，4X物镜下进行克隆环计数。所述的步骤e中的培养上清为：DM/F12培养基中加入8-10％的Gibco10099-141胎牛血清，每100mL培养基加入L-谷氨酰胺200mM。本专利技术的第四方面，提供一种用于肝癌循环肿瘤细胞悬滴培养法的试剂，包括上述的温敏型生物凝胶和悬滴培养法培养上清，所述的悬滴培养法培养上清为：DM/F12培养基中加入8-10％的Gibco10099-141胎牛血清，每100mL培养基加入L-谷氨酰胺200mM。本专利技术的第五方面，提供一种上述的用于肝癌循环肿瘤细胞悬滴培养法的试剂在悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞中的应用。本专利技术优点在于：1、本专利技术的温敏型生物凝胶以羟丁基壳聚糖和泊洛沙姆为骨架，添加了肿瘤细胞所在的细胞外基质(ECM)所含有的IV型胶原、透明质酸与硫酸氨基葡糖多聚糖等组分，充分模拟肿瘤在体内的生长环境，使肝癌CTC可以在凝胶中生长，并通过分泌IV型胶原酶溶解部分机制，形成显微镜下可见的克隆环，从而实现计数的可操作性；同时在培养上清中添加重组人表皮生长因子(rh-EGF)，使每一个CTC都可以在凝胶中充分生长，提高计数的敏感性。2、本专利技术的温敏型生物凝胶在4℃下呈现溶液状态，在溶液状态下可以加入循环肿瘤细胞，使其在凝胶中充分混匀；37℃下呈现果冻状胶体，肝癌CTC种植后在固定位置生长。3、本专利技术的温敏型生物凝胶中的IV型胶原酶和透明质酸等成分在CTC生长过程中被其分泌的胶原酶、透明质酸酶等成分分解，形成折光度不同的克隆环，便于计数。4、本专利技术的温敏型生物凝胶与培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞的温敏型生物凝胶，其特征在于，由体积比为8:1:1的A液、B液和C液组成；所述的A液，包括生物凝胶的骨架溶液和基质溶液，7mL骨架溶液与1mL基质溶液在冰上混合，并用无菌铂金棒搅拌均匀，4℃保存，即得A液；所述的生物凝胶的骨架溶液：使用亲水链聚氧乙烯占60％以上的泊洛沙姆，配置体积分数为20‑45％的泊洛沙姆溶液；配置体积分数为0.2‑0.7％的羟丁基壳聚糖溶液；两种液体在冰上冰浴15min后，将两者按体积比1:1充分混合，获得所述的生物凝胶的骨架溶液；所述的生物凝胶的基质溶液：将0.5‑0.8mgIV型胶原、0.01‑0.1mg分子量为10000‑50000的透明质酸和0.01‑0.1mg硫酸氨基葡糖多聚糖于1mL超纯水中4℃下过夜溶解，获得所述的生物凝胶的基质溶液；所述的B液组分为10倍浓度的DM/F12培养基，每1mL B液中加入1000‑5000IU的rh‑EGF；所述的C液组分为pH＝2.5‑3.0的乳酸‑乳酸钠缓冲液0.025‑0.05mol。

【技术特征摘要】
1.一种用于悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞的温敏型生物凝胶，其特征在于，由体积比为8:1:1的A液、B液和C液组成；所述的A液，包括生物凝胶的骨架溶液和基质溶液，7mL骨架溶液与1mL基质溶液在冰上混合，并用无菌铂金棒搅拌均匀，4℃保存，即得A液；所述的生物凝胶的骨架溶液：使用亲水链聚氧乙烯占60％以上的泊洛沙姆，配置体积分数为20-45％的泊洛沙姆溶液；配置体积分数为0.2-0.7％的羟丁基壳聚糖溶液；两种液体在冰上冰浴15min后，将两者按体积比1:1充分混合，获得所述的生物凝胶的骨架溶液；所述的生物凝胶的基质溶液：将0.5-0.8mgIV型胶原、0.01-0.1mg分子量为10000-50000的透明质酸和0.01-0.1mg硫酸氨基葡糖多聚糖于1mL超纯水中4℃下过夜溶解，获得所述的生物凝胶的基质溶液；所述的B液组分为10倍浓度的DM/F12培养基，每1mLB液中加入1000-5000IU的rh-EGF；所述的C液组分为pH＝2.5-3.0的乳酸-乳酸钠缓冲液0.025-0.05mol。2.一种如权利要求1所述的温敏型生物凝胶在悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞中的应用。3.一种基于3D温敏型生物凝胶悬滴培养法体外计数肝癌循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)取肝癌患者10mL外...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁国善，王全兴，郭猛，刘芳，张铭健，展洋洋，鲍蕾蕾，郭闻渊，曹雪涛，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31