一种接种液组合物及利用其构建恶性胸腔积液来源异种移植瘤动物模型的方法技术

本申请涉及一种接种液组合物及利用其构建恶性胸腔积液来源异种移植瘤动物模型的方法。本发明专利技术提供的接种液包含以下组分：Hank's平衡盐缓冲液，胎牛血清，基底膜基质胶，和ROCK蛋白抑制剂。本发明专利技术构建恶性胸腔积液来源异种移植瘤动物模型的方法包括采集临床恶性胸腔积液样本、富集肿瘤细胞、利用本发明专利技术的接种液悬浮细胞并接种至动物以形成异种移植瘤的步骤。本发明专利技术的建模方法简单易行、成瘤率高，因此可用于各种伴有恶性胸腔积液的癌症特别是肺癌的药物筛选及机制研究。

【技术实现步骤摘要】
一种接种液组合物及利用其构建恶性胸腔积液来源异种移植瘤动物模型的方法
本专利技术属于医药模型领域。更具体而言，本专利技术涉及恶性胸腔积液来源的异种移植瘤动物模型的构建。
技术介绍
在我国，肺癌已代替肝癌成为首位恶性肿瘤死亡原因，而且发病率和死亡率仍在继续迅速上升。肺癌的高死亡率主要是因为60-70％的肺癌患者被发现时已是肺癌晚期，失去了手术机会无法根治。肿瘤动物模型是进行肿瘤相关机制和药物筛选研究的重要平台。目前，临床前肿瘤动物模型多采用肿瘤细胞系进行皮下接种的方法，其具有易建立和易重复等优点。但肿瘤细胞系因在体外建立，脱离了自然的肿瘤微环境，使其遗传不稳定且不能概括患者肿瘤的异质性。因此该方法建立的肿瘤动物模型，不能完全反映癌症病人复杂的临床症状，具有很大局限性。为了克服这些问题，研究者们建立了癌症病人来源的异体移植肿瘤动物模型，即将来源于患者的手术肿瘤组织移植入免疫缺陷小鼠体内。该模型非常好得维持了肿瘤移植物的组织学特性、基因表达谱、SNP位点和拷贝数变异等多个特征，因此可应用于病人的个性化药物筛选、生物标志物鉴定、临床前肿瘤药物药效评价和生物学机制研究等，为药物临床试验结果的预测提供了更加准确的结果。目前，肺癌患者来源肿瘤移植模型的建立方法主要是利用患者的手术组织移植入免疫缺陷小鼠皮下。虽然，在临床上很多肺癌患者经常合并发生的恶性胸腔积液，其他恶性肿瘤晚期也会伴发恶性胸腔积液，例如乳腺癌、淋巴瘤等恶性肿瘤(参见，林江涛等，胸膜活检联合胸水脱落细胞学检查在恶性胸腔积液诊断中的应用，《内科急危重症杂志》，2001，7(1))。然而，由于恶性胸腔积液中肿瘤细胞不仅数量较少，而且肿瘤细胞中含有已死亡或接近死亡的肿瘤细胞，除此之外胸水还含有免疫细胞及其他细胞，免疫细胞产生的炎症因子及其本身可能会杀伤肿瘤细胞。由于上述限制，一般认为，无法用恶性胸水来构建异种移植瘤动物模型。目前针对肺癌动物模型的研究方向主要是侧重于如何将手术采集到的肿瘤组织原位移植到动物中来构建异种移植瘤动物模型(王力伟等，移植性肺癌动物模型研究进展，《介入放射学杂志》，2015，24(7))。综上所述，本领域迫切需要一种利用恶性胸腔积液构建异种移植瘤动物模型的方法。
技术实现思路
根据本专利技术第一方面，提供了一种恶性胸腔积液来源异种移植瘤动物模型，所述动物模型由以下方法构建：(a)采集临床恶性胸腔积液样本；(b)富集所述恶性胸腔积液样本中的肿瘤细胞；以及(c)将如步骤(b)富集所得到的肿瘤细胞接种至实验动物，饲养动物至肿瘤形成，从而获得恶性胸腔积液来源的异种移植瘤动物模型。一个优选实施方式中，所述步骤(b)中使用FX系统进行细胞富集。一个优选实施方式中，将所述步骤(b)所获得的肿瘤细胞进行H&E染色，CK免疫荧光染色，以检测所富集的细胞是否为肿瘤细胞。一个优选实施方式中，将所述步骤(b)所获得的肿瘤细胞用无菌接种液处理，所述无菌接种液包含：45体积份的HBSS，5体积份的胎牛血清和50体积份的Matrigel胶，加入Thiazovivin，终浓度为10uM。另一个优选实施方式中，所述实验动物为重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠。另外一个优选实施方式中，所述恶性胸腔积液样本选自含有以下的基因型：EGFR20号外显子T790M突变、EGFR21号外显子L858R突变、和/或ALK融合基因。根据本专利技术第二方面，提供一种无菌接种液组合物，包含以下组分：Hank′s平衡盐缓冲液和/或磷酸缓冲液PBS，胎牛血清，基底膜基质胶，和ROCK蛋白抑制剂。一个优选实施方式中，所述基底膜基质胶选自Matrigel胶或CultrexBME胶；所述ROCK蛋白抑制剂选自Thiazovivin、Y-27632、吡那地尔(Pinacidil)、法舒地尔(Fasudil)、Ripasudil、RKI-1447、GSK429286A，或它们的任意组合。另一个优选实施方式中，所述Hank′s平衡盐缓冲液(购自Invitrogen，14170)为35-55体积份，胎牛血清为3-10体积份，基底膜基质胶为40-60体积份，并且ROCK蛋白抑制剂的终浓度为5-20uM。根据本专利技术第三方面，提供一种构建恶性胸腔积液来源异种移植瘤动物模型的方法，包括以下步骤：(a)采集临床恶性胸腔积液样本；(b)富集所述恶性胸腔积液样本中的肿瘤细胞；(c)使用根据本专利技术的无菌接种液组合物悬浮步骤(b)中富集的肿瘤细胞；以及(d)将如步骤(c)所述悬浮于无菌接种液组合物中的肿瘤细胞接种至实验动物，饲养动物至肿瘤形成，从而获得恶性胸腔积液来源的异种移植瘤动物模型。一个优选实施方式中，所述步骤(b)中使用FX系统进行细胞富集。另一个优选实施方式中，所述实验动物为重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠。另外一个优选实施方式中，所述恶性胸腔积液样本来自肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、或卵巢癌。根据本专利技术第四方面，提供一种根据本专利技术的方法构建的动物模型在临床或科研研究中的应用。一个优选实施方式中，所述应用选自药物筛选研究、药效学研究、药理学研究、患者响应性研究、基因特异性研究、生物标志物研究、和/或生物学机制研究。另外一个优选实施方式中，所述动物模型应用于选自以下的基因型：EGFR20号外显子T790M突变、EGFR21号外显子L858R突变、和/或ALK融合基因。本专利技术提供的技术方案能够利用恶性胸腔积液建模，因恶性胸腔积液采集方便，同时对患者生活影响小等特点，因此可多次建模，提高成功率。本专利技术提供的恶性胸腔积液建模技术方案可以针对丧失手术机会的晚期肺癌患者恶性胸水进行建模，从而可在临床和科研中的有很大的实际应用价值。本专利技术建立异种移植瘤动物模型的方法最大程度地保留了肿瘤的细胞生物学活性，忠实地还原了患者肿瘤细胞的相关特征，整个模型建立过程简单易行，成瘤率高达40％，因此可用于各种具有恶性胸腔积液的癌症特别是肺癌的药物筛选及机制研究。下面通过参考附图和具体实施方式进一步详细阐述本专利技术，但这些阐述仅仅是为了使本领域技术人员更好地理解和实施本专利技术，并不对本专利技术做任何形式的限制。除非另有说明，否则本文所用的所有科学和技术术语具有本专利技术所属和相关
的一般技术人员通常理解的含义。附图说明图1显示富集的肿瘤细胞的CK免疫荧光染色。图2显示富集的肿瘤细胞移植入小鼠皮下之后的肿瘤生长曲线。图3显示从恶性胸腔积液临床样本中富集的肿瘤细胞的苏木精伊红染色。图4显示ALK融合基因模型CTC15012的克卓替尼(Crizotinib)药效实验。图5显示EGFR21号外显子L858R突变模型CTC15008的吉非替尼(Gefitnib)药效实验。图6显示EGFR20号外显子T790M突变模型CTC15015的埃罗替尼(Erlotinib)药效实验。图7显示EGFR20号外显子T790M突变模型CTC15015的AZD9291药效实验。具体实施方式在本申请上下文中，术语“接种液组合物”、“接种液”、“无菌接种液”、“无菌接种液组合物”可互换使用。本申请上下文中的术语“包括”和“包含”可以相互替换使用，并同时涵盖了“由…组成”这一表述。在本专利技术中，如果没有特别说明，本文所提到的所有技术特征以及优选技术特征可以相互组合形成新的技术方案。在本专利技术中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无菌接种液组合物，包含以下组分：Hank's平衡盐缓冲液/磷酸缓冲液PBS，胎牛血清，基底膜基质胶，和ROCK蛋白抑制剂。

【技术特征摘要】
1.一种无菌接种液组合物，包含以下组分：Hank's平衡盐缓冲液/磷酸缓冲液PBS，胎牛血清，基底膜基质胶，和ROCK蛋白抑制剂。2.如权利要求1所述的无菌接种液组合物，其特征在于，其中所述基底膜基质胶选自Matrigel胶或CultrexBME胶；所述ROCK蛋白抑制剂选自Thiazovivin、Y-27632、吡那地尔(Pinacidil)、法舒地尔(Fasudil)、Ripasudil、RKI-1447、GSK429286A，或它们的任意组合。3.如权利要求1所述的无菌接种液组合物，其特征在于，所述Hank's平衡盐缓冲液为35-55体积份，胎牛血清为3-10体积份，基底膜基质胶为40-60体积份，并且ROCK蛋白抑制剂在所述接种液组合物中的终浓度为5-20uM。4.一种构建恶性胸腔积液来源异种移植瘤动物模型的方法，包括以下步骤：(a)采集临床恶性胸腔积液样本；(b)富集所述恶性胸腔积液样本中的肿瘤细胞；(c)使用如权利要求1-3任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆舜，闻丹忆，徐云华，张菲菲，徐文华，杨阳，陈智伟，
申请(专利权)人：上海市胸科医院，上海立迪生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31