本发明专利技术一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基及其生产纤溶酶方法属于微生物技术领域。包括有效成份胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、酵母提取物、7水硫酸镁和水；有效成份重量份配比胰蛋白胨8‑15、葡萄糖 30、磷酸二氢钾1、酵母提取物3、7水硫酸镁 0.2、水1000。一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基生产纤溶酶方法：① 将蝉拟青霉菌株（B5）接种到直径9cm的PDA平板上，25℃培养5天。② 将配好的液体培养基200 mL装入500 mL的三角瓶中，经121℃灭菌20 min,然后冷却至室温，用挑针挑取1块约3×3mm2的菌丝块，接种到配好的上述液体诱导培养基平板上，25℃摇床上以150rpm的转速培养6‑15天；③ 将上述培养液经10000转高速离心分离5分钟，取上清液作为纤溶酶粗提液备用。
Liquid culture medium for producing fibrinolytic enzyme by using cicada flower and production method thereof
The invention relates to a liquid culture medium for producing fibrinolytic enzyme by using a cicada flower and a production method thereof. The effective ingredients including tryptone, yeast extract, glucose, potassium dihydrogen phosphate, 7 Magnesium Sulfate water and water; effective component weight ratio 15, tryptone 8 glucose 30, KH2PO4 1, yeast extract 3, 7 Magnesium Sulfate 0.2, 1000 water water. Using a cicada producing fibrinolytic enzyme liquid medium production method: will plasmin Paecilomyces cicadae strains (B5) were inoculated into the PDA tablet 9cm diameter, 25 C were cultured for 5 days. The flask with good liquid medium 200 mL into 500 mL, 121 C 20 min after sterilization, and then cooled to room temperature, with the needle out of 1 pieces of approximately 3 x 3mm2 hyphae, inoculated into the liquid with a good medium plate, 25 degrees on the shaking table with the speed of Pei 150rpm raise 6 15 days; the the medium after 10000 to 5 minutes centrifugation, the supernatant was used as enzyme extract reserve.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基及其生产纤溶酶方法属于微生物
，具体涉及一种诱导的蝉拟青霉菌产生纤溶酶的液体培养基和培养方法。
技术介绍
血栓性疾病是一类致死率比较高常见疾病，主要包括脑血栓、肺动脉栓塞、冠状动脉血、静脉血栓栓塞、动脉粥样血栓、外周动脉血栓等，严重威胁人类健康。血栓疾病治疗的方式主要有手术除栓和药物除栓，现在主要通过方法为药物溶栓。据统计全世界各类血栓疾病患者多达1500多万人，而且这种疾病正有像低龄化发展的趋势，每年需要大量的溶栓药物。目前的溶栓药物根据作用方式分为两类，一类是活化体内的纤溶酶原，使其转化为纤溶酶发挥溶栓作用（间接作用）；另一类是对纤维蛋白具有降解作用，可以直接水解纤维蛋白从而达到溶栓作用（直接作用）。纤溶酶应该具有良好的特异性，即要达到溶栓的作用，又要副作用小，安全可靠。目前，在动物，植物，微生物，海洋微生物中都发现有天然来源的纤溶酶，但由于纤溶酶是一种蛋白质，往往具有抗原性过敏反应。蝉拟青霉(Paecilomycescicadae)是一种虫生真菌，属半知菌类炭角菌科。蝉拟青霉菌可以感染竹蝉的若虫，形成似花朵状的子座称为蝉花，是我国的一种传统中药。其有性阶段为Cordycepscicadae。蝉拟青霉不但有许多医疗保健作用，同时已经有上千年的食用历史，其安全性得到长期验证。由于蝉拟青霉已经能够人工培养，为实现规模化生产打下了基础。虽然其他虫草真菌如冬虫夏草（Cordycepssinensis）和蛹虫草（cordycepsmilitaris）中已经有纤溶酶的报道，但在蝉拟青霉中还没有报道。
技术实现思路
本专利技术目的是针对上述不足之处提供一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基及其生产纤溶酶方法。本专利技术比较了多种培养基对蝉拟青霉产生纤溶酶的影响，筛选到了可以高效诱导蝉拟青霉产生纤溶酶的培养基和培养方法。一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基及其生产纤溶酶方法是采取以下技术方案实现：一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基包括有效成份胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、酵母提取物、7水硫酸镁和水，有效成份重量份配比胰蛋白胨8-15、葡萄糖30、磷酸二氢钾1、酵母提取物3、7水硫酸镁0.2、水1000。本专利技术比较了多种培养基对蝉拟青霉产生纤溶酶的影响，筛选到了可以高效诱导蝉拟青霉产生纤溶酶的液体培养基。采用液体培养基发酵，蝉拟青霉产生纤溶酶优选培养基重量份配比是：胰蛋白胨10、葡萄糖30、磷酸二氢钾1、酵母提取物3、7水硫酸镁0.2、水1000。液体发酵体积大，操作方便，采用液体发酵更加容易得到大量的纤溶酶。培养时间可延长到10-15天。一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基生产纤溶酶方法，步骤如下：①将蝉拟青霉菌株（B5）接种到直径9cm的PDA平板上，25℃培养5天。②将配好的上述液体培养（液体诱导培养基）200mL装入500mL的三角瓶中，经121℃灭菌20min,然后冷却至室温。用挑针挑取1块约3×3mm2的菌丝块，接种到配好的上述液体诱导培养基平板上，25℃摇床上以150rpm的转速培养6-15天。③将上述培养液经10000转高速离心分离5分钟，取上清液作为纤溶酶粗提液备用。一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基及其生产纤溶酶方法优点：①蝉花已经长期食用，证明对人体安全可靠，不会产生不良免疫反应；②本专利技术液体培养基配方简单，容易配制。③用本专利技术液体，生产过程简单，只要在合适温度条件下（23-28℃，150rpm转速的摇床培养），纤溶酶即可大量分泌到培养基中。④适用于大量生产。附图说明以下将结合附图对本专利技术作进一步说明：图1是以尿激酶的纤溶酶活性制作的标准曲线。图2是不同诱导成分的液体培养基产生的纤溶酶活性的测定示意图。图中A：蛋白胨；B：酸水解酪蛋白；C：胰蛋白胨；D：淀粉；E：酪蛋白；F：麦芽浸膏；G：奶粉；H：大豆胨；CK：基本培养基。图3不同含量的胰蛋白胨对纤溶酶的诱导结果。具体实施方式参照附图1、2、3，一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基包括有效成份胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、酵母提取物、7水硫酸镁和水，有效成份重量份配比胰蛋白胨8-15、葡萄糖30、磷酸二氢钾1、酵母提取物3、7水硫酸镁0.2、水1000。本专利技术比较了多种培养基对蝉拟青霉产生纤溶酶的影响，筛选到了可以高效诱导蝉拟青霉产生纤溶酶的液体培养基。采用液体培养基发酵，蝉拟青霉产生纤溶酶优选培养基配方是：胰蛋白胨8-15g,葡萄糖30g,磷酸二氢钾1g，酵母提取物3g，7水硫酸镁0.2g,水1000mL。液体发酵体积大，操作方便，采用液体发酵更加容易得到大量的纤溶酶。培养时间可延长到10-15天。一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基生产纤溶酶方法，步骤如下：①将蝉拟青霉菌株（B5）接种到直径9cm的PDA平板上，25℃培养5天。②将配好的上述液体诱导培养基200mL装入500mL的三角瓶中，经121℃灭菌20min,然后冷却至室温。用挑针挑取1块约3×3mm2的菌丝块，接种到配好的上述液体诱导培养基平板上，25℃摇床上以150rpm的转速培养6-15天。③将上述培养液经10000转高速离心分离5分钟，取上清液作为纤溶酶粗提液备用。实施例1：一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基的筛选及培养方法：1所用的培养基（1）基本培养基：葡萄糖30g,磷酸二氢钾1g，酵母提取物3g，7水硫酸镁0.2g。水1000g。水1000g相当于水1000mL。（2）液体诱导培养基：在基本培养基中分别加入下面不同的成分各10g：蛋白胨（peptone）,酸水解酪蛋白，胰蛋白胨(tryptone),淀粉，酪蛋白（casein）,麦芽浸膏（maltextract）,奶粉，大豆胨（Soytone）,配成不同的诱导纤溶酶培养基。常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。（3）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potatodextroseagar,PDA）：将马铃薯200g切成小块，加水煮沸15min，然后2层纱布过滤后，弃去马铃薯块，在过滤液中加入葡萄糖20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。2蝉拟青霉中纤溶酶的液体培养基诱导培养：①将蝉拟青霉菌株（B5号）接种到直径9cm的PDA平板上，25℃培养5天。②用挑针挑取1块约3×3mm2的菌丝块，分别接种到各种配好的200mL的液体诱导培养基中，在25℃摇床上150rpm转速培养6天。③取1mL培养液转移到1.5mL的离心管中，10000转离心5分钟，取上清液作为纤溶酶粗提液备用。3、纤维蛋白凝固平板的制备及纤溶酶的诱导培养：①配制50mMTris–HCl缓冲液(pH7.8)：1.称量1.21gTris于100ml烧杯中；2.加入约80ml的去离子水，充分搅拌溶解；3.加入约0.5ml的浓盐酸调PH至7.84.定容到200ml5.高温高压灭菌后，室温保存。②将0.25g纤维蛋白原溶解到50mL配好的Tris–HCl缓冲液中，配成0.5%w/v的纤维蛋白原溶液。③纤溶蛋白平板的制备：0.1g琼脂糖加入5ml水中灭菌，冷却到约45℃时，然后再加入凝血酶溶液0.1mL，加入5mL纤维蛋白原溶液，混合均匀后倒平板本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基，其特征在于：包括有效成份胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、酵母提取物、7水硫酸镁 和水；有效成份重量份配比胰蛋白胨8‑15、葡萄糖 30、 磷酸二氢钾 1 、酵母提取物 3 、7水硫酸镁 0.2、水1000。
【技术特征摘要】
1.一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基，其特征在于：包括有效成份胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、酵母提取物、7水硫酸镁和水；有效成份重量份配比胰蛋白胨8-15、葡萄糖30、磷酸二氢钾1、酵母提取物3、7水硫酸镁0.2、水1000。2.根据权利要求1所述的一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基，其特征在于：采用液体培养基发酵，蝉拟青霉产生纤溶酶优选培养基重量份配比是：胰蛋白胨10、葡萄糖30、磷酸二氢钾1、酵母提取物3、7水硫酸镁0.2、水1000；液体发酵体积大，操作方便，采用液体发酵更加容易得到大量的纤溶酶；培养时间可延长到10-15天。3.权利要求1所述的一种利用蝉花生产纤溶酶的液体培养基生产纤溶酶方法，其特征在于：步骤如下：①将蝉...
【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，
申请(专利权)人：李伟，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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