本发明专利技术提供了一种例如通过靶向缺失体细胞近单倍体人类亲本细胞的一个或多个二体染色体区域可获得的体细胞完全单倍体、核型稳定的人类细胞系，一种产生该体细胞完全单倍体、核型稳定的人类细胞系的方法，以及该细胞系用于产生包含不同基因组靶位点处的基因组突变的等基因细胞变体的用途，以及一个此类细胞变体的文库。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及是完全单倍体的突变体细胞人类细胞系。
技术介绍
为了保护基因组完整性，人类是二倍体，即他们具有每个染色体的两个拷贝(除仅存在于一个拷贝中的X染色体和Y染色体之外)，一个来自他们的父亲并且一个来自他们的母亲。在许多情况下，如果一个染色体上的一个基因受损，那么剩余的第二拷贝足以维持基因功能，由此缓解另外的有害影响。对于人类作为一个物种的生存必不可少的这种故障保护机制证明是人类遗传学家的恶梦：每当一种基因的一个拷贝灭活时，第二拷贝通常缓冲该影响，由此掩蔽该具体基因的表型。对于最长的时间，已知是单倍体的人类细胞仅是配子，即精细胞和卵细胞。然而，由于这些细胞不能增殖，因此它们不能用于基因实验(除了伦理道德约束)。在超过15年前，一群科学家在塔夫斯大学(Tufts University)偶然发现了一种细胞系，该细胞系从患有慢性骨髓性白血病(CML)的患者中分离出来。被称为KBM-7[1]的该细胞系，除8号染色体和15号染色体的一部分被发现是二体的之外，对于大多数染色体是单倍体。它的近单倍体状态可在培养物中维持若干个月。然而最终，KBM-7细胞转变成二倍体[1]，这说明该近单倍体核型更适合表示一种“亚稳定”状态。虽然作者[1]指出，这种细胞系可用于“促进将体细胞遗传学应用到哺乳动物细胞生物学的研究”，但这花了超过10年的时间直到泰恩布鲁梅尔坎普(Thijn Brummelkamp)和他的同事在怀特黑德生物医学研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research)成功地将KBM-7细胞应用于人类细胞的基因实验[2]。在这篇划时代文章中，作者使用逆转录病毒载体将一个常规基因诱捕(gene trap)插入宿主基因组中并且由此在整合位点处破坏基因表达。最重要的是，由于逆转录病毒可在非常高滴度下生长，因此该方法允许在一个突变细胞的池中以非常高的覆盖率同时破坏大多数非必需人类基因，由此能够实现无偏阳性选择筛选[3]-类似于在超过15年前在酵母中完成的筛选。除了无偏遗传学筛选，由布鲁梅尔坎普开发的技术能够实现生成一个人类细胞系的独特文库，其中每个细胞系在一个限定位置处携带一个基因诱捕插入。重要的是，此类文库能够实现反向遗传学，即，对于考虑中的一个特定表型的个体突变体研究。这样一种文库最近被建立起来。该文库含有大概10,000个细胞系，覆盖超过3,500个人类基因[4]。此外，本公开通过下一代测序和小核苷酸多态性(SNP)阵列还含有亲本KBM-7细胞的详细基因组表征。基于这些数据，15号染色体上的二体部分可被映射到chr15:61,105,000-89,890,000周围的区域。当上述的遗传筛选非常强大时，它们显然受到近单倍体人类细胞系的可用性的限制-同时，KBM-7是唯一可用的细胞系。因此，布鲁梅尔坎普和同事决定重新编程KBM-7细胞以获得诱导性多能干细胞(iPSC)。虽然这证明是可行的，但KBM-7衍生的iPSC在去分化程序过程中失去了它们的近单倍体核型[5]。然而，这个反应的一个副产物是一种保持近单倍体并且显示成纤维细胞样形态的叫做HAP1的粘附细胞系[6]。重要的是，HAP1细胞不是多能的，但就生长、形态学和基因表达而言它们明显不同于它们的KBM-7亲本细胞。应注意，HAP1细胞对于8号染色体也是单体的，并且因此比它们的KBM-7亲本“更加单倍体”。然而，HAP1细胞确实保留来自15号染色体的二体片段并且因此不能被认为是完全单倍体。此外，HAP1细胞对于它们的近单倍体核型不如KBM-7稳定，即，它们比KBM-7细胞更容易地转变成二倍体状态。细菌具有维持它们基因组完整性并且抵御入侵的病毒和质粒的需要。最近，具有聚集、规则间隔、短回文重复(CRISPR)的基因组基因座在细菌中发现并且显示对入侵噬菌体介导适应性免疫[7]：细菌可捕获来自噬菌体的短核酸序列并且将它们整合到CRISPR基因座中。由CRISPR基因座的转录产生的小RNA可引导一组细菌内切核酸酶裂解入侵病原体的基因组。对于一种细菌内切核酸酶(来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CAS9)的最低要求通过将该酶纯化并且在体外重构裂解反应来进行表征[8]。出人类意料地是，CAS9自身足以进行内切核酸酶裂解并且不需要另外的多肽用于裂解反应。此外，CAS 9需要两个RNA辅因子：一个恒定tracrRNA和一个可变crRNA。重要的是，该crRNA可用于重新编程CAS9的裂解特异性，由此使CAS9能够靶向目标基因组基因座。裂解特异性受限于特异于CAS 9并且位于相邻裂解位点的原型间隔区相邻基序(PAM)。在试图简化该系统时，将crRNA和tracrRNA融合以得到一种被称为引导RNA的嵌合RNA分子。US 2010/0076057 A1披露靶DNA干扰crRNA和CRISPR相关联(cas)蛋白，特别是对于基于使用CRISPR序列的水平基因转移。通过CAS9-crRNA复合物进行的RNA指导的DNA裂解由WO 2013/141680 A1和WO 2013/142578 A1描述。本专利技术的目的是工程化近单倍体细胞以减小细胞的二倍性。另外的目的是提供一种核型稳定的单倍体核型的细胞系。
技术实现思路
通过如所权利要求的主题来实现该目的。根据本专利技术，提供一种体细胞完全单倍体、核型稳定的人类细胞系。确切地说，该细胞系是可通过靶向缺失一种体细胞近单倍体人类亲本细胞的一个或多个二体的(在此也称为二倍体的)染色体区域获得的。确切地说，该细胞系是一种粘附细胞系。根据一个具体实施例，该细胞系是保藏于DSM ACC3220下的HAP2细胞系或其功能性变体，优选地具有相似的基因表达谱。确切地说，功能性变体的特征在于基本上相同的基因表达谱，即，功能性变体包含其中基因的表达水平基本上相同的一个基因组，例如小于1000个基因、优选小于750、或小于500、或小于300个基因的基因表达水平将不同。命名为HAP2的细胞系是一种完全单倍体人类细胞系，该细胞系被提供为保藏在DSMZ-德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,Mascheroder Weg 1 b/Inhoffenstraβe 7B)38124 Braunschweig(DE)中，保藏登记号是DSM ACC3220(保藏日期：2013年11月21日；寄托人：奥地利维也纳的Haplogen GmbH(Haplogen GmbH,Vienna,Austria))的生物材料。该HAP2细胞系和功能性变体包含在单体状态中甚至至少20代的全套人类染色体。优选地，功能性变体的特征在于相似的基因表达模式。该细胞系的不同克隆可展现相同或相似的基因表达模式。例如，独立克隆可通过使一种亲本克隆突变来产生，这些独立克隆是核型稳定的并且具有基本上相同的基因表达谱。本专利技术细胞系证明是核型稳定的、优选的实例，诸如保藏材料或其功能性变体。该HAP2细胞系和功能性变体包含在单体状态中甚至至少20代的全套人类染色体。优选地，功能性变体的特征在于相似的基因表达模式。本专利技术细胞系的不同克隆可显示相同或相似本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种体细胞完全单倍体、核型稳定的人类细胞系。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.28 EP 13194939.8;2013.11.28 EP 13194940.6;1.一种体细胞完全单倍体、核型稳定的人类细胞系。2.如权利要求1所述的细胞系，该细胞系是一种粘附细胞系。3.如权利要求1或2所述的细胞系，该细胞系是保藏于DSM ACC3220下的HAP2细胞系或其功能性变体，优选地具有基本上相同的基因表达谱。4.如权利要求1至3中任一项所述的细胞系，包含在单体状态中的全套人类染色体。5.如权利要求1至4中任一项所述的细胞系，其中该单倍体核型在至少10代、优选在至少20代中是核型稳定的。6.如权利要求1至5中任一项所述的细胞系，通过靶向缺失一种体细胞近单倍体人类亲本细胞的一个或多个二体染色体区域可获得。7.如权利要求1至6中任一项所述的细胞系，该细胞系包含在预定义的目标基因组位点(GOI)处的一个或多个目标基因组突变(MOI)。8.如权利要求7所述的细胞系，其中该MOI是以下各项中的至少一种：(i)一种敲除基因功能的突变；(ii)一种引入缺失、取代或插入一个或多个核苷酸中的至少一种的突变；和/或(iii)一种引入同源模板的交换序列的突变。9.一种DNA制剂，包含从如权利要求1至8中任一项所述的细胞系提取的基因组DNA。10.一种产生如权利要求1至8中任一项所述的细胞系的方法，该方法包括：a)提供一种体细胞近单倍体人类亲本细胞；b)鉴别该亲本细胞的基因组中的一个二体区域；c)各自通过一种包含结合crRNA的tracrRNA的gRNA来靶向与该染色体区域DNA的5’末端和3’末端相邻的侧位点，该crRNA包括与靶位点杂交的一个寡核苷酸序列；d)在与一种RNA引导的内切核酸酶接触时在靶位点处裂解DNA，该RNA引导的内切核酸酶在与该gRNA杂交时催化DNA双链断裂，由此缺失该染色体区域并且获得一种完全单倍体细胞；以及e)扩大该细胞以获得一种完全单倍体细胞系。11.如权利要求10所述的方法，其中该亲本细胞来源于一种癌症患者，优选一种患有诸如慢性骨髓性白血病或急性成淋巴细胞性白血病的白血病或诸如周围性软骨肉瘤的实体瘤的患者。12.如权利要求10或11所述的方法，其中这些gRNA中的至少一个包含选自下组的一个序列，该组由以...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒂尔曼·布尔克斯图默尔，
申请(专利权)人：地平线基因公司，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT
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