一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，属于生物技术领域。其包括以下步骤：1）收集冬孢子；2）冬孢子悬液；3）冬孢子培养；4）单孢分离培养；5）显微观察；6）性亲和菌株筛选；7）PCR鉴定。通过以上方法可快速稳定地筛选得到菰黑粉菌单倍体菌株，同时通过融合实验初筛及PCR验证交配型基因可准确地获得配对的性亲和单倍体菌株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法。
技术介绍
菰黑粉菌属于担子菌亚门黑粉菌属，是一种典型的二型态真菌，与玉米瘤黑粉菌近源。目前为止，茭白是其所知的唯一寄主，而茭白孕茭是茭白植株与该专一性地寄生在体内的菰黑粉菌共同作用的结果。至今，茭白的种植及保种育种还是采用茭墩分离筛选的方式，人力物力投入较大，而且菰黑粉菌存在多个生理小种，其可能混合存在于茭白植株中，造成茭白品种性状不稳定，退化明显。因此采用人工接种方式是茭白育种的发展方向。研究表明菰黑粉菌的两个性亲和单倍体混合接种可以使野茭植株孕茭，即植株茎基部发生膨大，而非性亲和单倍体菌株混合、单一单倍体菌株、双核菌丝或冬孢子接种均无法使野茭植株孕茭（及由近源的玉米瘤黑粉菌研究进展可知黑粉菌的侵染需要两个性亲和单倍体一起混合接种），因此，菰黑粉菌性亲和单倍体的获得是保障茭白人工育种的前提。而由于自然界中菰黑粉菌以冬孢子或者双核菌丝存在，没有单倍体菌株。目前普遍采用的分离方法得到的菰黑粉菌一般是双核菌丝，而采用体外梯度稀释培养方式获得的菌株大部分为杂合的单倍体菌株或者双核菌丝，该方法不能标准化，无法保证产物的稳定性。因此我们通过对菰黑粉菌生活史及其生理特性研究，建立了一种快速稳定分离菰黑粉菌单倍体菌株的方法，并进行了成对的性亲和单倍体菌株的简易筛选鉴定。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法的技术方案。所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：1）收集冬孢子：从龙茭2号灰茭直接挑取冬孢子；从龙茭2号正常茭挑取冬孢子；2）冬孢子悬液：将挑取的冬孢子堆置于5 mL无菌水中，经过滤，获得较纯的冬孢子悬液，再用无菌水将冬孢子悬液稀释成终浓度为103个孢子/mL；3）冬孢子培养：取100 µL冬孢子悬液涂布于担孢子分离培养基上，28℃培养60 h，以肉眼可见细小分散的单菌落为标准；4）单孢分离培养：挑取单个肉眼可见的菌落至清水中，稀释成103个孢子/mL，每次取1 µL置于显微操作仪下用毛细吸管吸取单个担孢子，将分离出的担孢子在YEPS固体培养基上，28℃培养4 d；5）显微观察：对担孢子形成的菌落形态用光学显微镜进行显微观察，若菌落边缘光滑则可初步鉴定为单倍体菌株，若边缘产生了菌丝，则舍弃；6）性亲和菌株筛选：将初步鉴定的单倍体菌株编号，并用YEPS液体培养基分别稀释成浓度为OD600为1.5-2.0的菌液，通过融合反应实验对性亲和菌株进行初步鉴定，培养后若可见白色气生菌丝，则混合培养的两个菌株可能为性亲和单倍体菌株；7）PCR鉴定：设计特异性引物用于进一步对筛选得到的两个性亲和单倍体进行PCR验证，如性亲和单倍体菌株能通过不同的特异性引物扩增出长度在600 bp左右的片段，则确定为两个性亲和单倍体菌株，所述的特异性引物为引物pra1-F、引物pra1-R、引物pra2-F、引物pra2-R、引物pra3-F和引物pra3-R，所述的引物pra1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物pra1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物pra2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物pra2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，引物pra3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物pra3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤2）中采用4层灭菌纱布过滤。所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤3）中担孢子分离培养基含有以下组分：K2HPO4 0.85-1.15g/l，MgSO4·7H2O0.45-0.55g/l，FeSO4·7H2O0.008-0.012g/l，KCl 0.45-0.55g/l，葡萄糖16-20 g/l，(NH4)2SO45.0-5.5 g/l，琼脂10-15 g/l。所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤6）中融合反应实验具体过程为：a、选取一个单倍体菌株菌液先在YEPS固体培养基上进行点样，每个点1 µL，总点样数为分离得到的单倍体菌株数；b、将分离得到其它单倍体菌株的菌液各取1 µL分别覆盖于步骤a中的菌点上方，标记菌株号，于28℃培养箱中培养4 d。所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤7）中PCR条件为：PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.5 μL，加ddH2O至50 μL；PCR扩增程序为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 终止。通过以上方法可快速稳定地筛选得到菰黑粉菌单倍体菌株，同时通过融合实验初筛及PCR验证交配型基因可准确地获得配对的性亲和单倍体菌株。附图说明图1为菰黑粉菌单倍体菌株的分离及配对性亲和单倍体菌株筛选流程图；图2 为冬孢子在不同培养基上培养后的菌经PI染色后荧光显微观察图；图3为两个性亲和单倍体菌株在不同碳氮源培养基上融合生长表型图；图4 为灰茭和正常茭白中菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的分离及鉴定；图5为菌种及交配型基因的PCR鉴定结果图。具体实施方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实施例1：菰黑粉菌交配型位点的克隆分析根据在不同菰黑粉菌单倍体菌株中获得的部分a位点基因序列，结合实验室前期的菰黑粉菌基因组测序及部分菌株重测序结果，分析发现在菰黑粉菌中存在三个交配型a位点，分别为Ue a1，Ue a2和Ue a3，Ue a1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，Ue a2的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，Ue a3的左端基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，Ue a3的右端基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。其中Ue a1包含了部分lba（1-197 bp）、panC（7322-8000 bp），完整的pra1（4122-5437 bp）、mfa1.2（1131-1250 bp）、mfa1.3（2786-2911 bp）、rba（6652-7083 bp），片段总长8000 bp；Ue a2包含了部分lba（1-277 bp）、panC（8836-9594 bp），完整的pra2（2204-3421 bp）、mfa2.1（7330-7452 bp）、mfa2.3（1212-1331 bp）、rba（8307-8597 bp）；而Ue a3的位点基因比较特殊，a位点的基因被中间至少间距100kb的碱基隔断，将其分为两个片段，左端包含了完整的lba（1-1650 bp）、mfa3.2（2590-2709 bp）、pra3（4015-5493 bp），片段总长5493 bp；右端包含完整的panC（771-2066 bp）、rba（2305-2595bp）、mfa3.1（344本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：1）收集冬孢子：从龙茭2号灰茭直接挑取冬孢子；从龙茭2号正常茭挑取冬孢子；2）冬孢子悬液：将挑取的冬孢子堆置于5 mL无菌水中，经过滤，获得较纯的冬孢子悬液，再用无菌水将冬孢子悬液稀释成终浓度为103个孢子/mL；3）冬孢子培养：取100 µL冬孢子悬液涂布于担孢子分离培养基上，28℃培养60 h，以肉眼可见细小分散的单菌落为标准；4）单孢分离培养：挑取单个肉眼可见的菌落至清水中，稀释成103个孢子/mL，每次取1 µL置于显微操作仪下用毛细吸管吸取单个担孢子，将分离出的担孢子在YEPS固体培养基上，28℃培养4 d；5）显微观察：对担孢子形成的菌落形态用光学显微镜进行显微观察，若菌落边缘光滑则可初步鉴定为单倍体菌株，若边缘产生了菌丝，则舍弃；6）性亲和菌株筛选：将初步鉴定的单倍体菌株编号，并用YEPS液体培养基分别稀释成浓度为OD600为1.5‑2.0的菌液，通过融合反应实验对性亲和菌株进行初步鉴定，培养后若可见白色气生菌丝，则混合培养的两个菌株可能为性亲和单倍体菌株；7）PCR鉴定：设计特异性引物用于进一步对筛选得到的两个性亲和单倍体进行PCR验证，如性亲和单倍体菌株能通过不同的特异性引物扩增出长度在600 bp左右的片段，则确定为两个性亲和单倍体菌株，所述的特异性引物为引物pra1‑F、引物pra1‑R、引物pra2‑F、引物pra2‑R、引物pra3‑F和引物pra3‑R，所述的引物pra1‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物pra1‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物pra2‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物pra2‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，引物pra3‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物pra3‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。...
【技术特征摘要】
1.一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：1）收集冬孢子：从龙茭2号灰茭直接挑取冬孢子；从龙茭2号正常茭挑取冬孢子；2）冬孢子悬液：将挑取的冬孢子堆置于5 mL无菌水中，经过滤，获得较纯的冬孢子悬液，再用无菌水将冬孢子悬液稀释成终浓度为103个孢子/mL；3）冬孢子培养：取100 µL冬孢子悬液涂布于担孢子分离培养基上，28℃培养60 h，以肉眼可见细小分散的单菌落为标准；4）单孢分离培养：挑取单个肉眼可见的菌落至清水中，稀释成103个孢子/mL，每次取1 µL置于显微操作仪下用毛细吸管吸取单个担孢子，将分离出的担孢子在YEPS固体培养基上，28℃培养4 d；5）显微观察：对担孢子形成的菌落形态用光学显微镜进行显微观察，若菌落边缘光滑则可初步鉴定为单倍体菌株，若边缘产生了菌丝，则舍弃；6）性亲和菌株筛选：将初步鉴定的单倍体菌株编号，并用YEPS液体培养基分别稀释成浓度为OD600为1.5-2.0的菌液，通过融合反应实验对性亲和菌株进行初步鉴定，培养后若可见白色气生菌丝，则混合培养的两个菌株可能为性亲和单倍体菌株；7）PCR鉴定：设计特异性引物用于进一步对筛选得到的两个性亲和单倍体进行PCR验证，如性亲和单倍体菌株能通过不同的特异性引物扩增出长度在600 bp左右的片段，则确定为两个性亲和单倍体菌株，所述的特异性引物为引物pra1-F、引物pra1-R、引物pra2-F、引物pra2-R、引物pra3-F和引物pra3-R，所述的引物pra1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物pra1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物pra2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物pra2-...
【专利技术属性】
技术研发人员：张雅芬，叶子弘，崔海峰，俞晓平，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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