本发明专利技术公开了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CF‑3(保藏编号CCTCC No:M 2016125)及其制备方法，菌株分离自豆腐乳中。所述的枯草芽孢杆菌主要用于采后水果病害的防治。本发明专利技术枯草芽孢杆菌CF‑3对于多种采后水果疾病的病原真菌(番茄灰葡萄孢霉菌、草莓灰葡萄孢霉菌、荔枝炭疽菌、苹果黑腐皮壳菌、苹果扩展青霉菌、桃褐腐菌、枣仁果茎点霉菌与枣链格孢霉)有良好的抑制效果，抑菌谱广、效力高，具有对人畜无毒对生态环境友好等优点，而且其制备方法工艺简单、发酵周期短，可应用于果蔬采后保鲜。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株新筛选的枯草芽孢杆菌CF-3及其培养方法。
技术介绍
果蔬采后因病原菌引起的果蔬腐烂造成了严重的经济损失。长期以来为了控制采后果蔬的病害发生，主要采用化学杀菌剂的方法，但是化学杀菌剂的使用往往容易引起病原菌抗药性的产生，影响食品的安全性，造成环境污染等问题，生物保鲜方法被认为是最具有潜力的方法之一。所以，高效低毒低残留且与环境相容性好的果蔬采后保鲜方法成为了现在研究的热点。枯草芽孢杆菌是一种对许多植物病原生物具有拮抗作用的非病原微生物，其代谢系统发达，能够产生对高温、干旱和紫外线照射等不良环境具有良好抵御能力的内生芽孢，而且具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，安全，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种拮抗物质和一些高分子量的拮抗蛋白质，包括磷脂类、氨基酸类、核酸类、肽类、脂肽类与多烯类等多种化合物，具有潜在的医学应用与病害防治的价值，能够抑制病毒、细菌、真菌和菌原体等，并且在其生长代谢过程中还会产生许多挥发性物质(VOCs)，包括酯类、酮类、酸类、醛类与醇类等，在抑制病原菌生长方面也有不同程度上的功效。因此在生物防治杀菌剂中占主导地位，具有广阔的应用前景。病原真菌侵染一直是影响果蔬采后品质的主要原因，目前国内和国际上有许多关于利用生防菌防治植物病害的文献报道，对生防菌应用于果蔬采后真菌病害的防治作用研究较少，从整体上来看，抑菌谱窄、效力低是影响生防菌商业化应用的主要问题，因而筛选抑菌谱广、效力高的生防菌应用于果蔬采后生物防治成为一个新的研究热点。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供了一株新的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株，已于2016年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心,保藏名为BacillussubtilisCF-3，保藏编号CCTCCNo:M2016125。本专利技术的目的之二在于提供了该菌株的分离及培养方法。该枯草芽孢杆菌菌株是从购买的豆腐乳中分离、筛选而得，将每块豆腐乳(10克)放入装有100mL无菌水的锥形烧瓶中震荡10分钟，连续稀释至1～1×10-6倍，制备稀释液；将1mL不同浓度的悬液与冷却至55～60℃灭菌的NA固体培养基(牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，鱼粉蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2)混合，待其凝固后在30℃恒温培养箱中培养24小时；待平板上长出菌落后，挑取单个菌落分别接种于NA固体培养基进行平板培养；随后采用划线法对病原真菌进行菌丝抑制实验，选取抑制效果良好的生防菌菌株，于20mL灭菌的NA液体培养基中(牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，鱼粉蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2)，37℃，150rpm，摇瓶培养24h后，采用平板划线分离纯化，再次进行病原真菌的抑制实验，二次筛选后选取对病原真菌抑制效果最好的菌株，经过形态学以及生理生化与DNA鉴定后，命名为枯草芽孢杆菌CF-3。在NA固体培养基(牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，鱼粉蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2)及NA液体培养基中的培养温度为37℃，培养时间为24～48小时，在NA液体培养基摇瓶培养时转速为150rpm。在以上条件下，该菌株鉴定特征如下：为杆状细菌，革兰氏染色阳性，具有周生鞭毛，无荚膜。NA固体培养基：菌落颜色为淡黄色，半透明至不透明，边缘比中心厚。NA液体培养基：接种培养24小时，培养液为不透明的棕黄色液体。该菌生防活性具有紫外光稳定性、酸碱稳定性、热稳定性等优点，以对荔枝炭疽菌的抑制率为指标，CF-3发酵培养基中碳源、复合碳源、氮源、复合氮源、微量元素的最优的种类和浓度为甘露醇34.64g/L，玉米浆粉20.87g/L，果糖10g/L，硝酸钾浓度为1g/L，硫酸亚铁浓度为0.13g/L，氯化钙浓度为0.1g/L，pH为7.2。该菌的16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。一株枯草芽孢杆菌CF-3，该菌株的保藏编号CCTCCNo:M2016125。一种制备上述的一株枯草芽孢杆菌CF-3的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将每10克豆腐乳放入装有100mL无菌水的锥形烧瓶中震荡10分钟，连续稀释至1～1×10-6倍，制备稀释液；将1mL不同浓度的稀释液与冷却至55～60℃灭菌的NA固体培养基混合，待其凝固后在30℃恒温培养箱中培养24小时；待平板上长出菌落后，挑取单个菌落分别接种于NA固体培养基进行平板培养；随后采用划线法对病原真菌进行菌丝抑制实验，选取抑制效果良好的生防菌菌株，于20mL灭菌的NA液体培养基中，37℃，150rpm，摇瓶培养24h后，采用平板划线分离纯化，再次进行病原真菌的抑制实验，二次筛选后选取菌株，经过形态学以及生理生化与DNA鉴定后，命名为枯草芽孢杆菌CF-3。上述的NA固体培养基为：牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，鱼粉蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2。上述的NA液体培养基为：牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，鱼粉蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：该菌株对多达8种导致采后水果腐烂的常见病原真菌生长具有明显的抑制作用，抑菌谱广、效力高，并且其发酵条件简单，制备容易，可应用于果蔬采后保鲜。附图说明附图1为实施例2中枯草芽孢杆菌CF-3的显微镜照片。附图2为实施例3中枯草芽孢杆菌CF-3的系统发育树。附图3为实施例4中枯草芽孢杆菌CF-3的发酵培养液对于番茄灰葡萄孢霉菌(BotrytisCinerea，A组。A1为空白对照组，A2为处理组，后面以此类推)、草莓灰葡萄孢霉菌(BotrytisCinerea，B组)与3株荔枝炭疽菌(Colletotrictumgloeos，C、D、E组)的抑制作用。附图4为实施例4中枯草芽孢杆菌CF-3的发酵培养液对于苹果黑腐皮壳菌(ValsamaliMiyabeetYamada，F组。F1为空白对照组，F2为处理组，后面以此类推)、扩展青霉菌(Penicilliumexpansum，G组)、桃褐腐菌(Moniliniafructicola，H组)、仁果茎点霉菌(PhomapomirumThum，I组)与链格孢霉(Alternariaalternata(Fr.)Keissler，J组)的抑制作用。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例进行进一步解释本专利技术，但不对本专利技术构成任何限定。以下实施例中除了特殊说明外，均为本领域常规试剂与方法步骤。实施例1：枯草芽孢杆菌CF-3的分离纯化该枯草芽孢杆菌菌株是采用稀释平板法从购买的豆腐乳中分离、筛选而得。将每块豆腐乳(10克)放入装有100毫升无菌水的锥形烧瓶中震荡10分钟，之后连续稀释至10-6倍，制备稀释液；将1毫升不同浓度的悬液与冷却至55～60℃灭菌的NA固体培养基中混合，倒入培养皿中，待其凝固后在30℃恒温培养箱中培养24小时本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株枯草芽孢杆菌CF‑3，该菌株的保藏编号CCTCC No:M 2016125。
【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌CF-3，该菌株的保藏编号CCTCCNo:M2016125。2.一种制备根据权利要求1所述的一株枯草芽孢杆菌CF-3的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将每10克豆腐乳放入装有100mL无菌水的锥形烧瓶中震荡10分钟，连续稀释至1~1×10-6倍，制备稀释液；将1mL不同浓度的稀释液与冷却至55~60℃灭菌的NA固体培养基混合，待其凝固后在30℃恒温培养箱中培养24小时；待平板上长出菌落后，挑取单个菌落分别接种于NA固体培养基进行平板培养；随后采用划线法对病原真菌进行菌丝抑制实验，选取抑制效果良好的生防菌菌株，于20mL灭菌的NA液体...
【专利技术属性】
技术研发人员：高海燕，李培中，曾晴，徐新星，戴悦雯，尹京苑，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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