本发明专利技术公开了一种抑制橡胶树炭疽病菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，于2015年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10917，属于植物保护技术领域。同时公开了所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的培养方法和应用，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株经平板对峙实验筛选所得，能够有效抑制橡胶树炭疽病菌的生长，对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不易产生抗性，能够进行商业开发，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物保护
，具体涉及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13及其培养方法和应用。
技术介绍
d然橡胶是重要的战略物资，属于一种紧缺性资源。它与铁矿石、石油、煤炭并列为四大工业原料。在交通和国防工业上都发挥着巨大的作用，同时它又与国民经济状况、经济周期和金融货币政策及国家贸易政策有着紧密联系；因此d然橡胶种植业具有举足轻重的地位。d然橡胶的生产过程与农产品一样受季节和d气等因素影响，在我国热区农业发展中，在d然橡胶比较集中的产区，当地农民和农场职工把d然橡胶种植作为增收的支柱产业，大约有300多万人从事d然橡胶的种植生产。d然橡胶产业为我国的经济建设、国防安全都提供了强大的支持。为各地区的经济发展，和谐稳定都作出了巨大的贡献。橡胶炭疽病是橡胶树上的一种重要病害，橡胶炭疽病病情逐年严重，截止目前为止，该病在世界各植胶国均有发生。从苗圃小苗、大田幼树直至成龄开割胶树均可受到炭疽病为害。该病菌感染橡胶树的嫩叶、叶柄、嫩梢和果实，严重时引起嫩叶脱落，嫩梢回枯和果实腐烂，甚至形成僵果悬挂在树上。橡胶炭疽病自1906年Petch在斯里兰卡首次发现，近年来，国内橡胶产业形势发生了明显变化，种植、栽培、管理模式等的多元化，加上生态环境的改变，橡胶重要病害检测、监测和防控技术上出现一些新的问题。如，病害发生、灾变情况发生变化，病害疫情、发生及流行规律研究缺乏系统性，基础研究工作薄弱；病害监测，监测预警工作技术支撑不足；新发生和灾变危险性病害缺乏认识和技术储备；化学防治方法单一，存在生态和抗药性安全隐患；抗病橡胶种质资源情况不清楚，抗病性基因资源的挖掘和利用在病害防治中的巨大作用未得到充分发挥。综上所述，需要针对橡胶炭疽病的特征，开发出一种专治橡胶炭疽病的防治方法，填补现有技术的不足之处。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于针对现有技术的空白，提供一种抑制橡胶树炭疽病菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13是一种从橡胶树内分离筛选获得对橡胶树炭疽病菌具有拮抗作用的生防细菌菌株，对橡胶树炭疽病的防治具有重要意义。本专利技术的另一目的在于提供所述抑制橡胶树炭疽病菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的分离方法与在防治炭疽病灾害方面的应用。本专利技术为了实现上述目的采用如下技术方案：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，其保藏编号为：CGMCC No.10917，于2015年5月
27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。进一步的，所述枯芽孢杆菌K13分离自橡胶树叶。上述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的培养方法，包括如下步骤：将所述枯草芽孢杆菌接种于液体LB培养基中振荡培养得到；所述液体LB培养基的配方：每1000mL水中含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g；pH为7.4。进一步的，包括如下步骤：步骤一：将所述枯草芽孢杆菌接入马铃薯葡萄糖琼脂并密封，恒温培养，得到单菌落；步骤二：取所述单菌落转接至液体LB培养基中，密封，置于摇床上震荡培养，然后将所述液体LB培养基转移至LB固体培养基上，涂抹均匀，恒温培养，通过无限稀释法获得单一菌株；步骤三：对所述单一菌株分别进行对峙培养：取炭疽菌RC178的菌饼，置于LB平板培养基中间，在所述菌饼周围接种所述单一菌株，密封，恒温培养，根据所述单一菌株对炭疽菌RC178的抑菌作用，筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13；步骤四：取所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13在液体LB培养基中振荡培养，得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌种。进一步的，包括如下步骤：所述步骤一中：所述恒温培养条件为：将接种后的培养基倒置放入恒温培养箱中培养，温度为28℃，培养时间为48h。进一步的，包括如下步骤：所述步骤二中：所述恒温培养条件为：将LB固体培养基倒置放入恒温培养箱中培养的温度为28℃，培养时间为48h，置于摇床上震荡培养的温度为28℃，培养时间为12h。进一步的，包括如下步骤：所述步骤三中：将接种后的LB平板培养基倒置放入恒温培养箱中培养的温度为28℃，培养时间为4～7d；所述菌饼的直径为6mm；所述对峙培养设置3个重复，以只接种所述炭疽菌RC178，不接种所述单一菌株为对照；所述筛选方法为：采用两点对峙培养；挑取28℃恒温培养7d的拮抗菌和病原菌的同质等量菌丝，接种于距离PDA平皿中心1.5cm的2个点上，再置于28℃恒温箱中培养，逐日观察抑菌作用；上述对峙培养方式设3个重复，以仅接种病原真菌的平皿作为对照。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的基因序列如SEQ ID NO 1所示。上述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的应用，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13用于制备对橡胶树炭疽病菌有拮抗作用的生化试剂；用于制备对橡胶树炭疽病菌菌丝有抑制、致畸作用的生化试剂；用于制备对橡胶树炭疽病菌菌丝分生孢子萌发有抑制作用的生化试剂。本专利技术的有益效果在于：1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13为植物内生菌，对橡胶树炭疽病菌抑制作用强，对多种病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗细菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如：种类和数量众多，在植物叶际，叶内大量存在；对病原菌的作用方式多种多样，例如：
对橡胶树炭疽病菌有拮抗作用，对橡胶树炭疽病菌菌丝有抑制、致畸作用；对橡胶树炭疽病菌菌丝分生孢子萌发有抑制作用。繁殖速度快，对橡胶树炭疽病的防治具有重要意义。2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13对橡胶树炭疽病菌抑制作用强，有利于维持有益微生物的生态平衡，由于生防细菌所产生的抑菌物质通常直接针对相应的病原菌起作用，特异性强，故此不会对农业生态系统中其它有益微生物产生不利影响，有助于维持有益微生物的生态平衡。3、菌株培养条件简单，易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13：保藏编号为：CGMCC No.10917；保藏日期：2015年5月27日；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。附图说明图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13对橡胶树炭疽病菌的平板对峙拮抗作用图；(a)为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13与炭疽菌RC178对峙的结果1，(b)为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13与炭疽菌RC178对峙的结果2，(c)为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13与炭疽菌RC178对峙的结果3，(d)为对照组——炭疽菌RC178的培养结果；图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株的生长曲线。具体实施方式下文将结合附图详细描述本专利技术的实施例。应当本文档来自技高网...
【技术保护点】
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，其保藏编号为：CGMCC No. 10917，于2015年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
【技术特征摘要】
1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，其保藏编号为：CGMCC No. 10917，于2015年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，其特征在于，所述枯芽孢杆菌K13分离自橡胶树叶。3.权利要求1或2 任意一项所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述枯草芽孢杆菌接种于液体LB培养基中振荡培养得到；所述液体LB培养基的配方：每1000mL水中含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g；pH为7.4。4.权利要求3所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13分离培养：将已消毒的炭疽病斑叶片接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，密封，进行第一次恒温培养，后转接至另一马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，进行第二次恒温培养，纯化，得到纯化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，置于8~10℃培养箱中的斜面试管中保存；步骤二：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的纯化：取所述纯化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13转接至液体LB培养基中，密封，置于摇床上震荡培养，然后将所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13从液体LB培养基转移至LB固体培养基上，涂抹均匀，恒温培养，通过无限稀释法获得单一菌株；步骤三：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的筛选与培养将所述单一菌株转接到LB平板，然后用涂布平板法得到单菌落；取炭疽菌RC178的菌饼，置于LB平板培养基中间，在所述菌饼周围接种所述单菌落，密封，恒温培养，根据所述单一菌株对炭疽菌RC178的抑菌作用，筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13；步骤四：培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌种：取所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13在液体LB培...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑肖兰，郑金龙，贺春萍，易克贤，习金根，吴伟怀，梁艳琼，李锐，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：海南;46
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