对枯草芽孢杆菌T－500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法技术

本发明专利技术具体涉及一种对枯草芽孢杆菌T‑500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法，属于枯草芽孢杆菌T‑500脂肽类抗生素的发酵工艺技术领域。本发明专利技术以水稻纹枯病菌为指示菌，基于10种常用的发酵培养基，利用酸沉淀法提取脂肽类抗生素，并进行T‑500粗提液抑菌效果分析，筛选影响抑菌效果的发酵培养基成分；通过Plackett‑Burman实验设计、中心组合实验设计(CCD)和响应曲面法，优化了T‑500高产脂肽类抗生素的发酵培养基成分及发酵条件。本发明专利技术为枯草芽孢杆菌T‑500菌株工业化生产和获得高产脂肽类抗菌物质提供了技术支撑和理论指导。

Method for optimizing fermentation process of Bacillus subtilis T 500 high-yield lipopeptide antibiotics by shake flask

The present invention relates to one kind of Bacillus subtilis T 500 high lipopeptide Antibiotics Fermentation Process Optimization Method of shaking flask fermentation, which belongs to the technical field of Bacillus subtilis T 500 lipopeptide antibiotics. The present invention to Rhizoctonia solani as indicator bacteria and 10 kinds of fermentation medium based on Extraction of lipopeptide antibiotics by acid precipitation method, and T 500 crude extract antibacterial effect analysis, screening of antimicrobial effects of fermentation medium components; through the combination of experimental design of Plackett Center (CCD, Burman experimental design) and response surface method, the optimization of fermentation T 500 high lipopeptide antibiotic medium composition and fermentation conditions. The present invention provides technical support and theoretical guidance for the antimicrobial substance from Bacillus subtilis T strain 500 industrialized production and high yield of lipopeptide.

【技术实现步骤摘要】
对枯草芽孢杆菌T-500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法
本专利技术属于枯草芽孢杆菌T-500脂肽类抗生素的发酵工艺
，具体涉及一种对枯草芽孢杆菌T-500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法。
技术介绍
芽孢杆菌是一种目前研究较为深入的生防菌资源，它具有发达的分泌系统和较强的环境适应性，对多种植物病原菌具有拮抗性，且无毒、无污染、无残留，不易使病原菌产生抗药性，目前已被广泛应用于生物农药的创制和开发。国内外已推广应用的活性菌株有BacillusamyloliquefaciensFZB42，BacillussubtilisGB03和BacilluspumilusGB34等；陈志谊等开发的微生物杀菌剂“纹曲宁”，其活性成分为枯草芽孢杆菌Bs916，该制剂对水稻纹枯病、稻曲病具有良好防效。已有生防机理研究表明，芽孢杆菌非核糖体合成途径产生的脂肽类抗生素，如Surfactin(表面活性素)，Iturin(伊枯草菌素)和Fengycin(泛革素)等，具有直接杀死或抑制病原物生长、与病原菌进行营养和空间的竞争及诱导植物产生抗病性的作用。目前，芽胞杆菌发酵的常用培养基主要成分有小麦本文档来自技高网...

【技术保护点】
对枯草芽孢杆菌T‑500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤一：制备枯草芽孢杆菌T‑500的发酵种子液，并从发酵过程中得到的发酵液中提取脂肽类抗生素，脂肽类抗生素的提取具体为：将枯草芽孢杆菌T‑500发酵过程中得到的发酵液进行离心，上清液进行酸沉淀，调节pH，过夜，离心收集沉淀，晾干后，加入色谱级甲醇溶解沉淀，并调节pH，溶解后离心获得甲醇溶液，后用细菌滤器过滤，得到无菌甲醇滤液；步骤二：将发酵种子液接种于各培养基进行培养，分别测定菌含量和脂肽类抗生素的抑菌效果，比较各培养基对T‑500菌株发酵液菌含量和产脂肽类抗生素的影响，筛选较佳培养基成分；步骤三：培养基...

【技术特征摘要】
1.对枯草芽孢杆菌T-500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤一：制备枯草芽孢杆菌T-500的发酵种子液，并从发酵过程中得到的发酵液中提取脂肽类抗生素，脂肽类抗生素的提取具体为：将枯草芽孢杆菌T-500发酵过程中得到的发酵液进行离心，上清液进行酸沉淀，调节pH，过夜，离心收集沉淀，晾干后，加入色谱级甲醇溶解沉淀，并调节pH，溶解后离心获得甲醇溶液，后用细菌滤器过滤，得到无菌甲醇滤液；步骤二：将发酵种子液接种于各培养基进行培养，分别测定菌含量和脂肽类抗生素的抑菌效果，比较各培养基对T-500菌株发酵液菌含量和产脂肽类抗生素的影响，筛选较佳培养基成分；步骤三：培养基成分的Plackett-Burman设计：以步骤二中筛选出的较佳培养基的组成为基础，并结合装液量、转速，进行Plackett-Burman设计，筛选出培养基成分关键因素；培养条件的Plackett-Burman设计：采用Plackett-Burman设计，从培养条件中筛选对菌株T-500脂肽类抗生素抑菌效果具有显著影响的因子；步骤四：(a)：对培养基成分的Plackett-Burman实验结果进行回归分析，得主要因子编码方程，并对该回归模型进行方差分析，对培养基成分关键因素进行进一步筛选；(b)：对培养条件的Plackett-Burman设计结果进行回归分析，得主要因子编码方程，并对该回归模型进行方差分析，对培养条件关键因素进行进一步筛选；步骤五：(a)：根据培养基成分的Plackett-Burman实验结果，综合选出三个对脂肽类抗生素抑菌效果均产生显著影响的培养基成分关键因素，并确定中心点数值，然后利用三因素五水平中心组合实验进一步筛选最佳培养基成分组合，共设20组实验，每组三个重复；(b)根据培养条件的Plackett-Burman实验结果，选出三个对脂肽类抗生素抑菌效果产生显著性影响的因素，并确定中心点数值，然后利用三因素五水平中心组合实验进一步筛选最佳培养基条件组合，共设20组实验，每组三个重复；步骤六：(a)：选取三个由步骤四(a)获得的培养基成分关键因素，按照步骤四(a)进行三因素五水平的中心组合设计，对中心组合实验所得抑菌带宽度的数据进行回归分析，得主要因子编码方程，由该方程求得三因素的最优值，得到最佳发酵培养基；(b)：选取三个由步骤四(b)获得的培养条件关键因素，按照步骤四(b)进行三因素五水平的中心组合设计，对中心组合实验所得抑菌带宽度的数据进行回归分析，得主要因子编码方程，由该方程求得三因素的最优值，得到最佳培养条件。2.根据权利要求1所述的对枯草芽孢杆菌T-500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法，其特征在于，步骤一中所述的制备枯草芽孢杆菌T-500的发酵种子液具体为：将低温保存的枯草芽孢杆菌T-500菌种划线入LB固体培养基平板，静置培养后，挑取单胞接种于YPG液体中，震荡培养，即得发酵种子液；步骤一中所述酸沉淀时的pH＝2.0，过夜时的温度为4℃。3.根据权利要求2所述的对枯草芽孢杆菌T-500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法，其特征在于，步骤一中所述低温为-70℃，所述静置培养为于28℃静置培养24h，所述震荡培养为于28℃、180rpm下震荡培养12h。4.根据权利要求1所述的对枯草芽孢杆菌T-500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法，其特征在于，步骤二中所述培养基为如表1所示的1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号或...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔俊卿，刘永锋，刘邮洲，张荣胜，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32