环酯肽类抗生素黑莫他丁的高产菌株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了环酯肽类抗生素黑莫他丁的高产菌株及其构建方法。黑莫他丁的高产菌株是将S.himastatinicus sp.Nov的hmtA基因或者hmtB基因失活，由此获得himastatin高产突变株S.himastatinicus sp.Nov，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术通过失活S.himastatinicus sp.Nov的环脂肽类抗生素himastatin的生物合成基因簇上游的Mer家族转录调控基因hmtA和乙酰谷氨酸激酶基因hmtB而分别得到hmtA失活的突变株S.himastatinicus sp.Nov Ju2014和hmtB失活的突变株S.himastatinicus sp.Nov Ju2015。突变株S.himastatinicus sp.Nov Ju2014和Ju2015的himastatin的产量是野生型S.himastatinicus sp.Nov的10倍以上。因此，该环脂肽类抗生素himastatin两个高产突变株的成功构建为加速himastatin产业化进程带来了可能与希望。

【技术实现步骤摘要】
环酯肽类抗生素黑莫他丁的高产菌株及其构建方法
：本专利技术属于微生物基因工程和代谢工程领域，具体涉及环酯肽类抗生素黑莫他丁(himastatin)的高产菌株及其构建方法。
技术介绍
：环肽类化合物是一类以酰胺键形成的环状化合物，主要是由氨基酸、糖肽、脂肽和核苷肽经过一系列修饰后组合而成的复杂分子。该类化合物广泛存在于无脊椎动物(海绵、海鞘、苔藓虫类等)、细菌、蓝细菌、真菌和放线菌中，多数具有复杂新颖的结构特征，其最突出的特点是环状结构以及各种氨基酸衍生物结构单元。环状结构赋予该类化合物一定的物理刚性以及对蛋白水解作用的耐受性，而不同的衍生结构更使得该类化合物具备各种生理生化特质。因其多数具有出色的生物学性能(抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、免疫抑制活性、抗虫、抗疟及生理生化调控作用等)，使得该类化合物已经成为了合成化学、药物筛选和开发的重点关注对象。其中的一些化合物已经成功用于临床疾病的治疗。例如抗真菌作用短杆菌酪肽A(tyrocidineA)、用于器官移植抗排斥作用的环孢菌素A(cyclosporinA)、对甲氧西林耐药的金葡菌具有良好活性的万古霉素(Vancomycin)、对甲氧西林耐药金葡菌和万古霉素耐药肠球菌均具有良好的抗菌活性的达托霉素(daptomycin)等，均是该类化合物用于临床治疗的成功典范。但是，其中的一些环肽类化合物由于其水溶性较差、副作用较大或化合物的产量低等原因而退出了临床试验，但这也间接说明了对这些化合物进行结构改造和优化或提高其产量的必要性和迫切性。而且由于这些化合物多数具有复杂结构、众多的手性中心及闭环位置的选择严重制约着对这类化合物进行结构改造的效率或产业化的进程。针对传统的天然产物筛选和研发手段的局限性，在二十世纪九十年代发展出一种以基因工程和酶学研究为基础的生物合成技术——组合生物合成(combinatorialbiosynthesis)，不仅弥补了传统研究方法的不足，而且为生物医药领域的进一步拓展提供了新的研究思路和研究方向。而且随着基因组测序技术和基因重组技术等的飞速发展，组合生物合成已给生物学领域带来了革命性的变化，同时也给化学学科创造新的化学结构和构建化合物库带来了新的方法和提供了有益的补充。此外，抗生素的生物合成基因通常在染色体或巨型质粒的一段连续区域成簇排列的特征，(包括结构基因、自我抵抗基因、转运基因和调控基因)为进一步开发和改造抗生素提供了新的契机。截至2006年，已有近300种微生物次级代谢产物的生物合成基因簇得到克隆和功能鉴定，为利用组合生物合成技术、代谢工程技术和体外酶学技术来创造或改造以得到新的化合物奠定了基础。已经有诸多研究通过生物合成和组合生物合成技术成功完成了较多结构复杂的天然产物的结构修饰、改造或某些目标成分的定向积累，构建了一系列活性相当或活性较强的衍生物，或高产突变株，为链霉菌的基因工程改造提供了有益的方法学的借鉴样本，为解决日益棘手的病原微生物的耐药问题和肿瘤疾病的治疗带来了新希望。环脂肽类抗生素黑莫他丁(himastatin)，其结构如图1所示，体外活性分析显示其对革兰氏阳性菌有较好的抑菌活性，对P388细胞系和褪黑色素瘤B16细胞系有显著的细胞毒活性。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供黑莫他丁(himastatin)高产突变株Streptomyceshimastatinicussp.Nov。本专利技术的himastatin高产突变株Streptomyceshimastatinicussp.Nov，其是hmtA基因或者hmtB基因失活的Streptomyceshimastatinicussp.Nov，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供了himastatin高产突变株Streptomyceshimastatinicussp.Nov的构建方法，其特征在于，是将Streptomyceshimastatinicussp.Nov的hmtA基因或者hmtB基因失活，由此获得himastatin高产突变株Streptomyceshimastatinicussp.Nov，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供了hmtA基因或者hmtB基因在调控himastatin产量中的应用，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的原始菌株Streptomyceshimastatinicussp.Nov是一株陆源链霉菌，分别通过对其次级代谢产物的生物合成基因簇中的1个MerR家族转录调控基因、1个乙酰谷氨酸激酶基因的遗传改造得到了2株能高产himastatin的突变株Streptomyceshimastatinicussp.NovJu2014和Ju2015。用himastatin的培养基发酵菌株，用乙酸乙酯萃取发酵液，经过HPLC-DAD-UV的分析其次级代谢产物。以HPLC程序进行程序分析，HPLC分析图谱显示，洗脱时间在17.45min处并有特征紫外吸收值(λmax210,285)的流分，该流分应为himastatin。为了确保17.45min处并有特征紫外吸收值(λmax210,285)的流分为himastatin，故采用6L规模的发酵处理，随后通过HPLC-UV分析得到化合物1的纯品；经核磁共振分析，其1D(1H,13C)NMR光谱学数据与文献报道的himastatin的图谱完全一致，即确定保留时间17.45min处的化合物1是抗生素himastatin(其结构式如图1所示)。本专利技术还涉及到Streptomyceshimastatinicussp.Nov的全基因组扫描，和抗生素himastatin的生物合成基因簇的确认。为了找到抗生素himastatin生物合成的基因簇，我们采用了全基因组扫描的方法，利用Illumina’sSolexa测序技术，对Streptomyceshimastatinicussp.Nov菌株的全基因组DNA进行序列测定，基因注释的结果显示一个大小为60Kb的连续片段可能含有himastatin生物合成所必需的基因信息，进一步的生物信息学分析揭示20个开放阅读框约45Kb大小的DNA序列包含了抗生素himastatin生物合成中的调控、结构、自我抵抗、转运及后修饰等基因的信息(见图2)。基因簇的序列已经被EMBL数据库收录，序列号FR823394。本专利技术涉及到himastatin生物合成基因簇中负责起转录调控作用的基因hmtA(核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码的蛋白HmtA的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示)，乙酰谷氨酸激酶基因hmtB(核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其编码的蛋白HmtB的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示)，将其单独进行置换突变后可得到高产抗生素himastatin的工程菌株。在himastatin生物合成基因簇的上游，有个命名为hmtA的基因，它编码一个有247个氨基酸的多肽，通过生物信息学分析鉴定该肽链属于MerR家族转录调控子。为了验证本文档来自技高网...

【技术保护点】
himastatin高产突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov，其特征在于，其是hmtA基因或者hmtB基因失活的Streptomyces himastatinicus sp.Nov，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.himastatin高产突变株Streptomyceshimastatinicussp.Nov，其特征在于，其是hmtA基因或者hmtB基因失活的Streptomyceshimastatinicussp.Nov，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.一种权利要求1所述的himastatin高产突变株Streptomyceshimastatinicussp.Nov的构建方法，其特征在于，是将Strept...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠建华，马俊英，张云，李青连，黄洪波，宋永相，王博，谢运昌，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44