【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种恒温快速检测溶珊瑚弧菌的引物探针组合、试剂盒及应用。
技术介绍
1、溶珊瑚弧菌(vibrio coralliilyticus)，是引起珊瑚白化和溶解的致病菌之一，aurora-rizzi velasquez-rodriguez在2004年首次发现，目前已被确定为全球海洋病原体。由于溶珊瑚弧菌对珊瑚的致病性极强，珊瑚中的溶珊瑚弧菌进行快速准确的检测已成为了人们关注的问题。在缺乏有效治疗手段的背景下，建立起简便，灵敏，快速和准确的溶珊瑚弧菌检测方法，及时清理感染源，切断感染途径，能够有效阻止溶珊瑚弧菌病害对珊瑚造成的危害。
2、目前溶珊瑚弧菌的检测手段主要包括纯培养，基因测序，酶联免疫吸附试验(elisa)，免疫印迹以及pcr技术等分子生物学检测等方法。然而上述方法存在操作复杂、效率低、成本高，步骤繁琐等明显的局限性。因此建立起简便，准确，快速的可视化检测方法是未来溶珊瑚弧菌检测领域的研究方向。目前，rpa技术因其简便的操作、超强的特异性及灵敏度已被应用在多种核酸病毒的检测中来。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的pcr技术被局限在实验室的使用范围内，从而限制了它在资源匮乏的环境中的应用的技术问题，提供一种恒温快速检测溶珊瑚弧菌的引物探针组合、试剂盒及应用。
2、本专利技术的引物探针组合构建的试剂盒，运用于对环境样品的检测，能够快速确定环境中是否含有溶珊瑚弧菌。
3、为了实现本专利技术的上述目的
4、一种恒温快速检测溶珊瑚弧菌的引物探针组合，其包括rpa引物对和荧光探针；所述rpa引物对的序列如下：
5、正向引物：5'-acaagcggtggagcatgtggtttaattcga-3'(seq id no.1)；
6、反向引物：5'-ctgtctctcagttcccgaaggcacaagactgtctc-3'(seq id no.2)；
7、所述荧光探针的序列如下：
8、5'-gatgcaacgcgaagaaccttacctactct(fam-dt)gac(thf)(bhq1-dt)cctcagaagagact-3'。
9、上述的荧光探针序列中第29位g为fam-dt修饰碱基；第32位c为bhq1-dt修饰碱基。
10、本专利技术的另一个目的是提供上述的引物探针组合在制备恒温快速检测溶珊瑚弧菌的试剂盒中的应用。
11、本专利技术的又一个目的是提供一种恒温快速检测溶珊瑚弧菌的试剂盒，其包含上述的引物探针组合。
12、优选的，所述的试剂盒还包含荧光基础缓冲液、乙酸镁和超纯水。
13、本专利技术的又一个目的是提供上述的试剂盒在恒温快速检测溶珊瑚弧菌中的应用。所述的应用是在恒温快速检测环境样品中是否含有溶珊瑚弧菌中的应用。
14、优选的，所述的恒温为39℃。
15、本专利技术的又一个目的是提供一种恒温快速检测溶珊瑚弧菌的方法，包括以下步骤：
16、a.提取待检测样品的dna；
17、b.以步骤a的dna为模板，利用上述的引物探针组合或上述的试剂盒进行实时荧光重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；
18、c.若出现荧光信号，则该待检测样品含有溶珊瑚弧菌；若没有荧光信号，则该待检测样品不含有溶珊瑚弧菌。
19、优选的，所述实时荧光重组酶聚合酶扩增的反应体系为：10μm正向引物2μl，10μm反向引物2μl，10μm探针0.8μl，荧光基础缓冲液25μl，超纯水12.7μl，dna模板5μl和乙酸镁溶液2.5μl，共50μl。
20、优选的，所述实时荧光重组酶聚合酶扩增的反应条件为：39℃下反应20min。
21、优选的，所述dna的浓度为10-15ng/μl。
22、本专利技术具有以下有益效果：
23、1、本试剂盒建立的real-time rpa(实时荧光重组酶聚合酶扩增)技术只需在39℃下20min之内就能得到检测结果，检测设备小巧且易于携带，为现场以及资源匮乏的地方提供更加方便的检测手段。
24、2、该试剂盒的检测比qpcr更灵敏，同时反应速度比qpcr更迅速。
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1.一种恒温快速检测溶珊瑚弧菌的引物探针组合，其特征在于，包括RPA引物对和荧光探针；所述RPA引物对的序列如下：
2.权利要求1所述的引物探针组合在制备恒温快速检测溶珊瑚弧菌的试剂盒中的应用。
3.一种恒温快速检测溶珊瑚弧菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含荧光基础缓冲液、乙酸镁和超纯水。
5.权利要求1所述的引物探针组合或权利要求3或4所述的试剂盒在恒温快速检测溶珊瑚弧菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的恒温为39℃。
7.一种恒温快速检测溶珊瑚弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光重组酶聚合酶扩增的反应体系为：10μM正向引物2μL，10μM反向引物2μL，10μM探针0.8μL，荧光基础缓冲液25μL，超纯水12.7μL，DNA模板5μL和乙酸镁溶液2.5μL，共50μL。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述DNA的浓度为10-15ng/μL。
...【技术特征摘要】
1.一种恒温快速检测溶珊瑚弧菌的引物探针组合，其特征在于，包括rpa引物对和荧光探针；所述rpa引物对的序列如下：
2.权利要求1所述的引物探针组合在制备恒温快速检测溶珊瑚弧菌的试剂盒中的应用。
3.一种恒温快速检测溶珊瑚弧菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含荧光基础缓冲液、乙酸镁和超纯水。
5.权利要求1所述的引物探针组合或权利要求3或4所述的试剂盒在恒温快速检测溶珊瑚弧菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的恒...
【专利技术属性】
技术研发人员：李洁，刘青，张健，陈煜，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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