【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种短链脱氢酶的重组表达质粒、重组基因工程菌及其在制备手性醇(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，尤其涉及一种该短链脱氢酶bcsdr4的基因构建的工程菌在不对称还原制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
技术介绍
1、将羰基不对称还原为光学仲醇以制备重要医药中间体是当下医药研发的一个重要途径，例如，4-氯乙酰乙酸乙酯(cobe)可以被不对称还原为(r)-chbe与(s)-chbe两种对映异构体，其中(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((r)-chbe)可以不对称合成抗生素、大环内酯类药物、γ-氨基羟基丁酸、环己二烯酮药物、肉碱等，广泛用于抗菌消炎、阿尔兹海默症、心血管疾病、膳食疲劳环节等相关药物的合成。其中大环内酯a和负霉素抗生素能抑制细菌蛋白合成和细菌增殖，r-(-)-肉碱是一种促进脂肪氧化分解、缓解疲劳的膳食成分，也可以通过(r)-chbe合成。
2、(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的合成方法主要包括化学法与生物催化法。化学法是指在一定条件下，加入钌等金属手性催化剂，但由于该方法存在着催化剂价格昂贵、反应条件苛刻、反应设备精密度要求高、环境污染等缺点，发展存在局限性。和化学合成法相比，生物法制备由于具有反应条件温和、反应步骤简单、环境污染小、成本低等优点，能够解决化学制备法中的一些弊端而受到关注。其中生物法又包括不对称还原法和外消旋体拆分法，外消旋体拆分法是利用酶催化剂选择性的和其中一个对映体反应，生成其他物质，另一个对映体不参与反应或者反应速率相对较小，进而实现对映异构体的分离。而生物不
3、本专利技术通过土壤筛菌获得了一株可以高效转化4-氯乙酰乙酸乙酯(cobe)为(r)-chbe的野生菌株burkholderia cepacia，并通过基因工程菌构建获得bl21(de3)-pet-28a(+)-bcsdr4重组大肠杆菌，最后将bcsdr4用于酶催化不对称还原cobe制备重要手性关键中间体(r)-chbe的反应。本专利技术的研究工作为通过基因挖掘与bl21(de3)-pet-28a(+)-bcsdr4重组大肠杆菌构建实现对底物cobe催化效果的提高，以期实现低成本、绿色高效的催化模式。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种大量土壤筛菌分离策略，筛选出一种可不对称还原cobe制备生成(r)-chbe的菌株burkholderia cepacia(cgmcc no:28566)，以及一种基因工程重组菌的构建及其在不对称还原cobe制备手性关键中间体(r)-chbe的应用。本专利技术通过土壤富集筛菌与限制性筛选的模式将筛得的野生菌株burkholderia cepacia进行新型羰基还原酶基因的挖掘并在此基础上构建基因工程菌，并通过优化获得一种由异丙醇和水组成的体系，进一步提高酶在催化体系中的活性、稳定性，提高生物催化效率。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)wz-5，所述洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)wz-5保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no:28566，保藏日期2023年9月27日，保藏地址：中国北京，中国科学院微生物研究所。
4、本专利技术还提供上述洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)wz-5在不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
5、第二方面，本专利技术提供一种短链脱氢酶的重组表达质粒，所述短链脱氢酶的氨基酸序列如seq id no：4所示。
6、在本专利技术的一个实施例中，所述重组表达质粒的载体为pet28a(+)载体。
7、进一步，所述短链脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。
8、更进一步，所述重组表达质粒是将seq id no：3所示核苷酸序列插入pet28a(+)载体的ncoi位点和ndei位点之间得到的。
9、具体地，所述重组表达质粒按如下方法构建：
10、s1:通过以下引物，以洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia wz-5)的基因组dna为模板进行pcr，得到目的基因：
11、f：5’-aagaaggagatataccatggatgatttcattcaacggcaagacc-3’
12、r：5’-cagtcatgctagccatatgtcagaaattgaagccgttgccc-3’
13、s2：用限制性内切酶ncoi和ndei对步骤s1所述目的基因进行双酶切，得到插入片段；用限制性内切酶ncoi和ndei对pet28a(+)载体进行双酶切，得到线性化载体；将所述插入片段与所述线性化载体连接，得到所述重组表达质粒。
14、在本专利技术的一个实施例中，步骤s2中所述连接的方式为无缝克隆。
15、第三方面，本专利技术提供一种所述重组表达质粒构建的重组基因工程菌。
16、在本专利技术的一个实施例中，所述重组基因工程菌的宿主菌为e.coli bl21(de3)。
17、第四方面，本专利技术还提供上述重组基因工程菌在不对称还原羰基类化合物制备醇类化合物中的应用，所述羰基类化合物为式a-l中的一种(优选为b、f、k)。尤其优选在不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯(k)制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
18、具体地，所述应用为：
19、以羰基类化合物为底物，以ph 7.0、0.1m磷酸缓冲盐溶液(pb)为反应介质，以异丙醇为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以nad(p)h为辅酶，以所述重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或所述湿菌体经超声破碎、分离纯化提取的短链脱氢酶纯酶为催化剂，构建反应体系，25-45℃、100-220rpm条件下反应12-36h(优选30℃、180rpm、24h)，得到含醇类化合物的反应液。
20、优选地，所述应用为：以4-氯乙酰乙酸乙酯(cobe)为底物，以ph 7.0、0.1m磷酸缓冲盐溶液(pb)为反应介质，以异丙醇为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以nad(p)h为辅酶，以所述重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或所述湿菌体经超声破碎、分离纯化提取的短链脱氢酶纯酶为催化剂，构建反应体系，25-45℃、100-220rpm条件下反应12-36h(优选30℃、180rpm、24h)，得到含(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的反应液。
21、进一步，所述反应体系中，底物的终浓度为10～40mm(优选40mm)，葡萄糖的终浓度为0.01-0.1g/ml(优选0.1g/ml)，nad(p)h的终浓度为0.2-0.8mm(优选0.2mm)，所述催化剂的用量以湿菌体的质量计，终浓度为80-120g/l(优选120本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种短链脱氢酶的重组表达质粒，其特征在于：所述短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQID NO：4所示。
2.如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒的载体为pET28a(+)载体。
3.如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述短链脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.如权利要求1-3任一项所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒是将SEQ ID NO：3所示核苷酸序列插入pET28a(+)载体的NcoI位点和NdeI位点之间得到的。
5.如权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒按如下方法构建：
6.如权利要求1所述的重组表达质粒构建的重组基因工程菌。
7.如权利要求6所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组基因工程菌的宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
8.如权利要求6所述的重组基因工程菌在不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述反应体系中，底物的终浓度为10～40mM，葡萄糖的终浓度为0.01-0.1g/mL，NAD(P)H的终浓度为0.2-0.8mM，所述催化剂的用量以湿菌体的质量计，终浓度为80-120g/L，异丙醇的体积浓度为5％-30％。
...【技术特征摘要】
1.一种短链脱氢酶的重组表达质粒，其特征在于：所述短链脱氢酶的氨基酸序列如seqid no：4所示。
2.如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒的载体为pet28a(+)载体。
3.如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述短链脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。
4.如权利要求1-3任一项所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒是将seq id no：3所示核苷酸序列插入pet28a(+)载体的ncoi位点和ndei位点之间得到的。
5.如权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒按如下方法构建：
6.如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：欧志敏，王延妮，邓立霞，王娜娜，刘美，陶紫娟，戴艳梅，张清宇，黄长顺，罗亮丽，唐岚，杜理华，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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