生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物的喹啉酸生产方法技术

本发明专利技术涉及一种生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物生产喹啉酸的方法，所述重组微生物表达这样的融合蛋白，其中L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶由接头连接。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物的喹啉酸生产方法
本专利技术涉及生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物生产喹啉酸的方法。
技术介绍
喹啉酸(quinolinicacid)也被称为2,3-吡啶-二羧酸，在医药、农药、染料等诸多领域中被用于化学合成物的前体。上述喹啉酸可以通过化学或生物合成方法制备。化学合成方法将来自石油的不可再生(non-renewable)材料作为原料使用，因此会受到环境问题和油价或石油提取单位成本的影响。作为生物合成方法的代表性的例子，公开了在下述大肠杆菌(E.coli)中生产喹啉酸的方法：在去除了喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的大肠杆菌中，通过克隆具有编码L-天冬氨酸氧化酶(NadB)和喹啉酸合成酶(NadA)的基因的不同拷贝数的质粒，使上述两种基因的表达得到增强(Eur.J.Biochem.175,221-228(1988),DE3826041)。此时，产生的喹啉酸的浓度为500mg/L或以下的非常低的水平。生成如此低浓度的喹啉酸的第一个原因是NadR的转录抑制，其为编码L-天冬氨酸氧化酶的nadB和编码喹啉酸合成酶的nadA的与NAD相关的转录抑制子。第二个原因是NAD导致的L-天冬氨酸氧化酶——NadB蛋白质的反馈抑制。第三个原因是大肠杆菌中由碳源至L-天冬氨酸的生物合成途径变弱。为了解决第一个原因，在韩国专利公报第10-2012-008267号中，使用了微生物菌株来将喹啉酸的产量提高到5.5g/L，其中将在转录阶段受到抑制的喹啉酸生物合成基因L-天冬氨酸氧化酶(NadB)和喹啉酸合成酶(NadA)的启动子区域替换为组成型启动子(constitutivepromoter)，并增强了L-天冬氨酸生物合成路径。通过生物合成方法由L-天冬氨酸合成喹啉酸的生物合成途径如以下反应方案所示。1)L-天冬氨酸氧化酶(NadB)L-天冬氨酸+氧<＝>过氧化氢+α-亚氨基丁二酸+H+2)喹啉酸合成酶(NadA)α-亚氨基丁二酸+磷酸二羟丙酮<＝>喹啉酸+磷酸+2H2O上述喹啉酸生物合成途径中的中间代谢产物α-亚氨基丁二酸是一种不稳定的物质，具有在细胞内由天然的脱氨基反应，转化为草酰乙酸酯的特性(THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,Vol.257,No.2,IssueofJanuary25.pp.626-632,1982)。通常，当不稳定的中间代谢产物被用作基质时，如果上述基质与酶之间的碰撞频率不高，则会生成大量的副产物。但是，目前为止还没有为解决与喹啉酸的生产相关的上述问题而进行的尝试。另一方面，将异种酶或蛋白质通过氨基酸接头连接，使它们表达为一个蛋白质的融合蛋白技术，被用于各种目的，例如将表达量少的蛋白质与表达量多的蛋白质连接，从而增加上述蛋白质的表达量，或者制备成与标记(Tag)连接的融合蛋白，从而提高蛋白质的纯化率等。已知接头的设计对于制备融合蛋白是重要的。通常，多使用具有α-螺旋结构的螺旋形接头或结构上具有柔性(flexibility)的柔性接头，并且例如，根据想要实现的融合蛋白的特性，可通过组合上述两种接头设计和使用各种接头(CancerRes2005；65:(16).August15,2005)。公开技术问题本专利技术人尝试通过表达由不同类型的氨基酸接头连接而成的NadB和NadA的融合蛋白，来解决由不稳定的代谢产物导致的反应降低，并发现与现有的生物学生产方法相比，通过表达所述融合蛋白能够以高收率生产喹啉酸，从而完成本专利技术。技术方案本专利技术的目的是提供生产喹啉酸的重组微生物，其表达由接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。本专利技术的另一个目的是提供生产喹啉酸的方法，包括培养上述重组微生物的步骤和回收在上述培养过程中产生的喹啉酸的步骤。有益效果根据本专利技术，通过提供表达由接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的微生物，能够将现有生物学生产工序中的α-亚氨基丁二酸的自然分解反应最小化，由此能够以高产率生产喹啉酸。附图说明图1显示了根据本专利技术一具体实施方案的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的结构。图2显示了pPro-NBA、pNBHL1A、pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A、pNBFL4A质粒的结构。图3显示了表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸转氨酶的基因的质粒pCPA的结构。优选实施方案的详述作为一个实施方案，本专利技术提供了生产喹啉酸的重组微生物，其表达由接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。上述L-天冬氨酸氧化酶(以下，称为“NadB”)作为具有将L-天冬氨酸氧化为亚氨基丁二酸的活性的酶，可以具有由SEQIDNO.42表示的氨基酸序列或与之有高同源性的氨基酸序列。[L-天冬氨酸氧化酶的活性]L-天冬氨酸+延胡索酸<＝>α-亚氨基丁二酸+琥珀酸+H+，或者，L-天冬氨酸+氧<＝>过氧化氢+α-亚氨基丁二酸+H+编码上述酶的基因nadB的序列可以从文献(MolSystBiol.2006；2:2006.0007.Epub2006Feb21)中公开的大肠杆菌(Escherichiacoli)的基因组序列(gi:GI:89109380)或者例如美国国家生物技术信息中心(NCBI)及日本DNA数据库(DDBJ)等数据库中获取。上述喹啉酸合成酶(以下，称为“NadA”)作为具有从亚氨基丁二酸合成喹啉酸的活性的酶，可以具有由SEQIDNO.43表示的氨基酸序列或与之有高同源性的氨基酸序列。[喹啉酸合成酶的活性]α-亚氨基丁二酸+磷酸二羟丙酮<＝>喹啉酸+磷酸+2H2O编码上述酶的基因nadA的序列可以从文献(MolSystBiol.2006；2:2006.0007.Epub2006Feb21)中公开的大肠杆菌的基因组序列(gi:GI:89109380)或NCBI及DDBJ等数据库中获取。如果增强上述NadB和NadA的活性，则在细胞内作为喹啉酸前体的α-亚氨基丁二酸的蓄积与从α-亚氨基丁二酸至喹啉酸的生物合成增加，从而可以增加喹啉酸的生产量。但是，由于上述α-亚氨基丁二酸是不稳定的代谢物，尽管上述两种酶(NadB及NadA)的活性和表达量增加，如果α-亚氨基丁二酸与NadA的接触频率不高，则会生成大量的副产物，由此无法像期待的那样有效地生产喹啉酸。为了解决这个问题，本专利技术使NadB及NadA以通过接头相互连接的融合蛋白的形式在菌株中得到表达，从而能够以高收率生产喹啉酸。上述NadB及NadA可以具有分别由SEQIDNO.42和43表示的氨基酸序列，但根据微生物的种类或菌株，显示上述活性的蛋白质的氨基酸序列可能存在差异，因此不限定于此。即，只要上述NadB及NadA是以通过接头相互连接而制备的融合蛋白形式提供，从而有助于增加喹啉酸的产率，它们可以是在SEQIDNO.42和43的氨基酸序列的一个或多个位置上，具有由一个或多个氨基酸的替换、缺失、插入或添加等而变异的氨基酸序列的突变体或人工变异体。在本文中，“多个”可根据蛋白质的三维结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产喹啉酸的重组微生物，其表达由接头连接的L‑天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.01.06 KR 10-2012-00018451.一种生产喹啉酸的重组微生物，其表达由接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白，其中所述接头由5～30个氨基酸组成，并且所述微生物为大肠杆菌(E.coli)。2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶分别由SEQIDNO.42和SEQIDNO.43表示的氨基酸序列组成。3.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述接头由LA(EAAAK)nAAA或L(GGGS)nAAA的氨基酸序列组成，其中每个n为1～5的整数。4.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述接头由选自SEQIDNO.54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列组成。5.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述融合蛋白由选自SEQIDNO.47、48、49、50、51、52和53的氨基酸序列组成。6.根据权利要求1所述的重组微生物，其中喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性与天然微生物中的内在活性相比被进一步弱化。7.根据权利要求6所述的重组微生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：申容旭，金素影，许仁庚，金朱恩，孙晟光，李在熙，李沚泫，金昌谦，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR