一种高效杀灭滴虫等医学原虫的细菌培养上清液的制备方法和及其利用技术

本发明专利技术公开了一种高效杀灭滴虫等医学原虫的细菌培养上清液的制备方法和及其利用,在厌氧培养基等基础培养基中添加了促进厌氧菌生长的营养物质以促进厌氧菌生长,该厌氧菌为高毒性艰难梭菌，携带艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B基因，分泌毒素A和B，同时携带二元毒素B的基因，分泌二元毒素。所述上清液中含有毒素A和B以及二元毒素，能破坏原虫细胞运动细胞器官，实现治疗原虫疾病的目的；所述厌氧培养基包括动物肠上皮水解产物以及甲醇，动物肠上皮水解产物添加量为1～5％(V/V)，甲醇添加量为10～100mg/L。该培养基能长时间保存，高效培养艰难梭菌并提高艰难梭菌毒素分泌量，保证培养上清液中杀灭医学原虫的有效成分含量。

Method for preparing bacterial culture supernatant capable of effectively killing medical protozoan such as trichomonad and its use

The invention discloses a method for efficiently killing trichomonas and other protozoa bacterial culture supernatant and its preparation method and use in the anaerobic medium basal medium added nutrients to promote the growth of anaerobic bacteria in order to promote the growth of anaerobic bacteria, anaerobic bacteria for the high toxicity of Clostridium difficile, Clostridium difficile toxin A and difficult to carry Clostridium difficile toxin B gene, the secretion of toxin A and B, while carrying two yuan B toxin gene, two toxin secretion. The supernatant containing A toxin and B toxin as well as two yuan, can destroy the protozoan cell movement organ, to achieve the purpose of the treatment of protozoal diseases; the anaerobic medium including animal intestinal epithelial hydrolysate and methanol, animal intestinal epithelial hydrolysate dosage of 1 ~ 5% (V/V), methanol concentration is 10 ~ 100mg/L. The culture medium can be stored for a long time, effectively cultivate Clostridium difficile and increase the toxin secretion of Clostridium difficile, and ensure the effective component content of the medical protozoan in the supernatant.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病原生物学领域，具体涉及一种高效杀灭滴虫等医学原虫的细菌培养上清液的制备方法和及其利用方法。
技术介绍
原虫为单细胞真核动物.医学原虫是寄生在人体腔管、体液、组织或细胞内的致病及非致病性原虫,约有40余种，医学原虫感染后容易引起阿米巴性痢疾、阿米巴性脓肿(以上主要为溶组织阿米巴)、阴道毛滴虫感染等疾病。原虫感染可发生在人体任何部位和组织，随着经济发展，大部分原虫性疾病逐渐减少，但是近年来由于受性概念的转变，阴道滴虫病发病又有上升，美国每年妇女感染人数为300万，全世界为1.8亿，国外资料表明：滴虫感染率与性接触次数有关，成年处女感染率为零。我国上世纪50年代滴虫的感染率已婚妇女为20％左右，上世纪70年代发病率明显下降，以性机能旺盛期为易感年龄。在局部原虫感染治疗中、特别是阴道滴虫病治疗中局部治疗常常用灭滴灵(甲硝唑)或凝胶消毒剂，而灭滴灵有致癌作用，不适合孕妇等特殊人群使用，而且灭滴灵和消毒剂容易导致局部微生物菌群平衡失调，导致瘙痒等不适感。
技术实现思路
为克服上述技术缺陷，本专利技术提供了一种广高效杀灭滴虫等医学原虫的细菌培养上清液的制备方法和及其利用方法，具有毒性低、效果块、配制方法简便等特点。本专利技术目的是通过采用以下技术方案实现的：一种高效杀灭滴虫等医学原虫的细菌培养上清液的制备方法和及其利用方法，其特征在于：所述培养基包括自配基础培养基、促进艰难梭菌生长的添加剂、蒸馏水和促进艰难梭菌毒素分泌的添加剂。所述促进艰难梭菌生长的添加剂为动物肠上皮水解产物；所述添加液与蒸馏水的体积比为1:99～5:95；所述促进艰难梭菌毒素分泌的添加剂为甲醇:所述甲醇添加量为10～100mg/L:优选的，所述自配基础培养基的配方为可溶性淀粉10g/L，酵母浸出液5g/L，磷酸氢二钠0.1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，维生素B20.1g/L。优选的，所述动物血液水解产物为鸟类或哺乳类动物肠上皮，处理温度为190度以上200度以下,处理压力2个大气压以上。优选的，所述甲醇其纯度在99％以上。优选的，所述培养基的制备方法包括如下步骤：(1)将动物肠上皮在190度以上200度以下温度和2个大气压以上的条件进行水解，制备细菌生长促进剂；(2)按自配基础培养基配方称取可溶性淀粉10g/L，酵母浸出液5g/L，磷酸氢二钠0.1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，维生素B20.1g/L，加入所述细菌生长促进剂和所述蒸馏水，混匀，121℃高压灭菌25min；所述细菌生长促进剂与蒸馏水的体积比为1:99～5:95；(3)灭菌后放置室温冷却至60℃后添加甲醇50mg。优选的，所述培养细菌为艰难梭菌；优选的，所述艰难梭菌可分泌艰难梭菌毒素A和B以及二元毒素B；优选的，所述艰难梭菌为ATCCBAA-1805菌株；优选的，所述艰难梭菌培养上清液，可以以原始状态(液态)使用，使用浓度为1～10％左右的水溶液；优选的，所述艰难梭菌培养上清液，可以经过浓缩干燥使用，使用时浓度为10～1000mg/L。优选的，所述艰难梭菌培养上清液，可以经过蛋白盐析、沉淀等精化后使用，使用时浓度为1～100mg/L。优选的，所述的上清液处理物可添加到外用药物使用与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术培养基利用了细菌生长促进剂，可促进艰难梭菌的生长和毒素的分泌，提高培养上清中的毒素含量，达到能够杀灭原虫的浓度。(2)本专利技术方法所获得的培养上清液可以低毒性、短时间、高效的杀灭局部的原虫。具体实施方式为使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1：本专利技术培养基和传统培养基对艰难梭菌生长对比测试1、配制传统培养基秤取脑心浸液肉汤(BHI)培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)38.5g，现配1L液体培养基，分注试管后121度、1.2个大气压灭菌15分钟后，接种艰难梭菌ATCCBAA-1805设为对照组。2、配制添加艰难梭菌生长促进剂、未添加促进艰难梭菌毒素添加剂的培养基(1)取100ml猪肠(购买自农贸市场)用剪刀剪碎，均匀搅拌后使用高温高压反应釜进行水解，温度设定195度，压力设定2.1大气压，经过1个小时处理后过滤，滤过液倒入玻璃瓶，再次进行灭菌(121度、1.2大气压、15分钟)备用。(2)称量可溶性淀粉10g，酵母浸出液5g，磷酸氢二钠0.1g，磷酸二氢钾1.5g，维生素B20.1g，加入(1)中的50ml动物肠上皮水解液和950ml蒸馏水，混匀，分注试管后121℃高压灭菌25min，室温冷却，接种艰难梭菌ATCCBAA-1805设为实验组1。3、使用氮气驱逐氧气后将对照组和实验组1放入厌氧罐中培养，24小时后在OD600进行检测，以OD600数据推测生长情况(详见表一)。实验结果说明动物肠上皮水解产物能促进艰难梭菌的生长，作为本专利技术中的关键组分。实施例2：添加促进艰难梭菌毒素添加剂的本专利技术培养基和未添加促进艰难梭菌毒素添加剂的本专利技术培养基以及传统培养基对比测试1、配制添加促进艰难梭菌毒素添加剂的培养基在进行实施例1的同时，配制添加促进艰难梭菌毒素添加剂的培养基，称量可溶性淀粉10g，酵母浸出液5g，磷酸氢二钠0.1g，磷酸二氢钾1.5g，维生素B20.1g，并溶于1L蒸馏水中，混匀，于121℃高压灭菌25min后室温冷却，温度下降到60度后添加50mg甲醇，分注试管中，接种艰难梭菌ATCCBAA-1805设为实验组2。2、与对照组和实验组1同样氮气排空气后厌氧培养24小时后使用艰难梭菌毒素A/B检测试剂(C.DIFFICILETOXA/BII试剂盒，购自美艾利尔(中国)医疗器械有限公司)检测毒素A和B浓度以及OD值(详见表二)。实验结果显示只添加促进毒素添加剂虽然能够提高毒素分泌，但是提高艰难梭菌生长的作用不大。实施例3：添加促进艰难梭菌毒素添加剂和促进艰难梭菌毒素添加剂的本专利技术培养基以及传统培养基对比测试在进行实施例1和2的同时，配制添加促进艰难梭菌生长添加剂和毒素添加剂的培养基，称量可溶性淀粉10g，酵母浸出液5g，磷酸氢二钠0.1g，磷酸二氢钾1.5g，维生素B20.1g，以及动物肠上皮水解产物50ml，溶于950ml蒸馏水中，混匀，于121℃高压灭菌25min后室温冷却，温度下降到60度后添加50mg甲醇，分注试管中，接种艰难梭菌ATCCBAA-1805设为实验组3。与对照组和实验组1、实验组2同样氮气排空气后厌氧培养24小时后使用艰难梭菌毒素A/B检测试剂(C.DIFFICILETOXA/BII试剂盒，购自美艾利尔(中国)医疗器械有限公司)检测毒素A和B浓度以及OD值(详见表三)。实验结果显示本专利技术培养基能够同时提高艰难梭菌生长速度和毒素分泌。实施例4：皮肤粘膜毒性实验将实施例3的试管进行离心，收集培养上清液，使用过滤灭菌器进行过滤灭菌，分成三份，一份作为原液，一份进行低温浓缩干燥，一份进行盐析脱盐精制待用。选取健康雄性小白鼠(KM小鼠，15日龄)30只，剃毛露出皮肤，分成三组进行皮肤毒性实验；第一组：直接涂抹原液，6次/日；第二组：使用无菌蒸馏水溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效杀灭滴虫等医学原虫的细菌培养上清液的制备方法和及其利用，在自配厌氧菌培养基中添加了促进艰难梭菌生长的营养物质和促进艰难梭菌毒素分泌的成分；所述厌氧菌自配培养基成分为可溶性淀粉0.8％～1.2％，酵母浸出液0.4％～0.6％，磷酸氢二钠0.08％～0.12％，磷酸二氢钾0.1％～0.2％，维生素B2 0.01％～0.02％；所述促进艰难梭菌生长的营养物质为动物肠上皮水解产物；所述促进艰难梭菌生长的营养物质动物肠上皮水解产物与蒸馏水的体积比为1:99～5:95；所述促进艰难梭菌毒素分泌的成分为甲醇；所述促进艰难梭菌毒素分泌的成分甲醇添加量为10mg～100mg/L。

【技术特征摘要】
1.一种高效杀灭滴虫等医学原虫的细菌培养上清液的制备方法和及其利用，在自配厌氧菌培养基中添加了促进艰难梭菌生长的营养物质和促进艰难梭菌毒素分泌的成分；所述厌氧菌自配培养基成分为可溶性淀粉0.8％～1.2％，酵母浸出液0.4％～0.6％，磷酸氢二钠0.08％～0.12％，磷酸二氢钾0.1％～0.2％，维生素B20.01％～0.02％；所述促进艰难梭菌生长的营养物质为动物肠上皮水解产物；所述促进艰难梭菌生长的营养物质动物肠上皮水解产物与蒸馏水的体积比为1:99～5:95；所述促进艰难梭菌毒素分泌的成分为甲醇；所述促进艰难梭菌毒素分泌的成分甲醇添加量为10mg～100mg/L。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基的配方为可溶性淀粉1.0％，酵母浸出液0.5％，磷酸氢二钠0.1％，磷酸二氢钾0.15％，维生素B20.01％。3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述促进艰难梭菌生长的营养物质为动物肠上皮水解产物为动物肠上皮高温高压水解产物，水解反应所需的温度为190度以上200度以下，压力为2个大气压以上。4.权利要求1-3所述的培养基的制备方法，其特征在于，所述培养基的制备方法包括如下步骤：(1)采用190度以上200度以下的高温和2个大气压以上压力水解动物肠上皮，动物肠上皮可为鸟类以及哺乳动物肠上皮；(2)按所述基础培养基的配方称取可溶性淀粉10g\...

【专利技术属性】
技术研发人员：玄英花，邓超，张馨心，程洋，延根，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32