一株耐低温石油降解芽孢杆菌、培养方法及其应用技术

本发明专利技术涉及耐低温石油降解菌株、培养方法、及其应用。本发明专利技术的耐低温菌芽孢杆菌的培养方法包括：将石油污染土样利用生理盐水溶解，摇床振荡后静置分层，将菌悬液接入原油无机盐液体培养基中，摇床培养后取液体培养基中适量下层发酵液，接种至新鲜无机盐液体培养基中继续培养，如此反复进行5次。对所得菌液进行梯度稀释，涂布至原油无机盐固体培养基上培养，观察培养基菌落数量，选择数量适中的培养基，进行划线培养；反复驯化、划线培养，直至得到多株纯菌。本发明专利技术的耐低温菌芽孢杆菌优先降解原油组分中的中长链饱和烷烃，该菌可应用于石油烃降解和土壤或水体石油污染的生物修复中，尤其可用于低温环境。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及耐低温石油降解菌株、培养方法、及其应用。本专利技术的耐低温菌芽孢杆菌的培养方法包括：将石油污染土样利用生理盐水溶解，摇床振荡后静置分层，将菌悬液接入原油无机盐液体培养基中，摇床培养后取液体培养基中适量下层发酵液，接种至新鲜无机盐液体培养基中继续培养，如此反复进行5次。对所得菌液进行梯度稀释，涂布至原油无机盐固体培养基上培养，观察培养基菌落数量，选择数量适中的培养基，进行划线培养；反复驯化、划线培养，直至得到多株纯菌。本专利技术的耐低温菌芽孢杆菌优先降解原油组分中的中长链饱和烷烃，该菌可应用于石油烃降解和土壤或水体石油污染的生物修复中，尤其可用于低温环境。【专利说明】一株耐低温石油降解芽孢杆菌、培养方法及其应用
本专利技术属于环境污染物生物处理
，具体涉及在低温环境下降解石油烃的菌株、其培养方法，以及其在土壤环境污染修复中的应用。
技术介绍
石油是一种粘稠易燃的、颜色从黄到黑的气态、液态和固态碳氢化合物的混合物，天然条件下存在于地表之下，含有多种烃类(正烷烃、支链烷烃、芳烃、脂环烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、环烷酸类等)的复杂混合物。作为目前世界上最重要的一次能源之一，同时也是许多化学工业产品如化肥、杀虫剂、塑料等的原料，石油具有非常重要的战略地位以及庞大的消耗量，世界各国都十分重视石油的开采和使用。目前，世界上石油开采主要分为陆地开采和海洋开采，其中陆地开采产量约占全球开采量的70%以上。我国已经找到的油气田大约500多个，同时已经开发了包括克拉玛依、大庆、胜利、华北、辽河、中原等一系列大的油田。大规模开采的同时也引发了诸多的环境污染问题。石油进入土壤，不但破坏土壤生态系统的结构和功能，降低土壤质量，还可以附着在植物的根系表面，影响作物的根系生长。此外，石油烃污染物可随地面降水渗透到地下水，进而污染浅层地下水环境，影响饮用水的水质。而且石油中所含的多环芳烃物质具有致癌、致畸、致突变等作用，能通过食物链在动植物体内逐级富集，严重威胁到农作物的质量和人类健康。诸多研究表明，土壤环境中的天然微生物种群对石油烃的降解作用是石油烃类污染物从土壤环境中消除的基本途径之一。与物理、化学等修复技术相比，生物修复技术具有安全、高效、生态友好和经济等特点。微生物利用自我调控机制以及对污染物的综合净化功能处理土壤中的石油烃类污染物，使这些污染物在微生物的新陈代谢过程中得到较为彻底的转化和降解，如转化成毒性较低的物质或CO2和水，不会产生二次污染，是应用前景最为乐观的土壤石油污染物处理方法。但是，以往的研究.多集中在利用常温或高温微生物进行环境污染生物治理，对于低温环境的研究较少。在高山、高纬地区，尤其是我国北方的油田地区，气候寒冷的条件下微生物存活率较低、自然降解能力较差，严重影响了石油污染地区土壤质量。近年来，低温环境对有机污染物的影响的研究越来越受到环境微生物学者的重视。有研究表明在北极、南极和高山冻土地区的土壤中存在大量耐冷的或嗜冷的土著石油烃降解微生物。此外，在石油污染的盐碱土壤中也存在一些耐盐的石油烃降解菌。这些嗜冷菌、嗜热菌或者耐盐微生物为特殊条件下的石油污染修复提供了种质资源。常见的低温石油降解菌主要有假单胞菌属(Pseudoalteromonas)、诺卡氏菌属(Nocardia)、恶臭假单胞菌属(Pseudomonasputida)、沙门氏菌属(Salmonella)、变形菌门(Proteobacteria)等。这些菌能在低温环境中发挥对石油烃类物质的生物利用。因此，筛选低温环境条件下优势石油降解菌株将为建立适合低温环境石油污染土壤的生物治理技术提供重要技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有低温条件下利用微生物修复石油烃污染土壤存在的难题，提供能高效降解石油的土壤微生物。本专利技术所提供的高效降解菌来源于天津大港油田附近石油污染的土壤，经人工驯化、分离纯化得到。本专利技术提供的一种菌株Bacillus sp.DG24，属于革兰氏染色阳性蜡状芽孢杆菌，菌落呈红棕色，不透明，菌落直径大约1.5mm (24h)，菌株16SrDNA的GenBank登录号为JN216879，该菌株于2011年7月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；邮政编码:100101)保藏，保藏编号为CGMCC N0.5051，分类学命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，属于革兰氏染色阳性菌。本专利技术还涉及Bacillus sp.DG24的培养方法，即驯化及纯化方法，包括以下步骤:(I)将石油污染土样利用生理盐水溶解，摇床振荡后静置分层，将菌悬液接入原油无机盐液体培养基中，在10-15°C摇床培养10-15天，后取液体培养基中适量下层发酵液接种至新鲜原油无机盐液体培养基中继续培养10-15天，如此反复进行3-5次。(2)吸取定量步骤(I)所得原油无机盐液体培养基中发酵液，进行梯度稀释，分别均匀涂布至原油无机盐固体培养基上，培养8-15天，观察培养基菌落数量，选择数量适中的培养基，进行划线培养。(3)反复驯化、划线培养，直至得到多株纯菌。优选地，步骤(I)所用原油无机盐液体培养基，每IOOOml培养基液体中含:0.4gNa2HPO4,0.15g KH2PO4,0.1gNH4Cl, 0.05g MgSO4.7Η20，0.0015g CaCl2,0.1g NaNO3,0.0OlgFeSO4.7Η20，ImL微量元素，其中微量元素由每IOOmL纯水中加入0.5mg CuSO4.5H20, 1.0mgH3BO3, 1.0mg MnSO4.5Η 20，7.0mg ZnSO4配制得到，其中，1000ml培养基液体还包括0.5?2g灭菌原油，优选lg。优选地,步骤(2)所用原油无机盐固体培养基由下述方法得到:在每IOOOml由0.4g Na2HPO4, 0.15g KH2PO4, 0.1gNH4Cl, 0.05g MgSO4.7Η20，0.0015g CaCl2,0.1g NaNO3,0.0Olg FeSO4.7Η20, ImL微量元素组成的培养基液体中，其中微量元素由每IOOmL纯水中加入 0.5mg CuSO4.5H20, 1.0mg H3BO3, 1.0mg MnSO4.5H20, 7.0mg ZnSO4 配制得到，另外加入15?20g琼脂，再在培养基表面均匀涂20?30 μ I灭菌原油。优选地，Bacillus sp.DG24的培养方法还包括保存步骤，具体为:将含Bacillussp.DG24菌体的乳化原油无机盐液体培养基，置于4°C条件下保存，每隔40-50天吸取该乳化原油液体培养基下层水相10_20ml接入新鲜已灭菌且还没有加入降解菌的原油液体培养基中按驯化方法进行操作，10-15天后将发生乳化现象的原油液体培养基置于4°C条件下再次保存；所述乳化原油液体培养基通过下述方法得到:用灭菌接种环挑取反复驯化纯化后在原油无机盐固体培养基中划线培养的Bacillus sp.DG24菌落接入原油无机盐液体培养基中，放于培养箱中10°C培养。优选地，Bacillus sp.DG24的培养方法的保存步骤之后，还包括富集培养步骤，具体为:吸取本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株耐低温石油降解菌，Bacillus?sp.DG24菌，属于芽孢杆菌属，保藏编号为CGMCC?No.5051。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王红旗，花菲，赵一村，
申请(专利权)人：北京师范大学，
类型：发明
国别省市：