克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法及培养基技术

本发明专利技术提供了一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法，克里本类芽孢杆菌菌种活化，在一级种子液体培养基和二级液体培养基培养以扩大繁殖，得到强健的菌体和孢子，将二级种子液接种到复合的碳源和氮源形成的三级液体培养基上，使克里本类芽孢杆菌的快速生长和产芽孢。三级液体培养基包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水。得到的发酵液中活菌数为10‑50亿CFU/ml，喷雾干燥后，得到菌粉的收率为10％‑15％。采用本发明专利技术的技术方案最终获取孢子含量较高的克里本类芽孢杆菌粉。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵
，具体涉及克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法及克里本类芽孢杆菌的培养基。
技术介绍
克里本类芽孢杆菌(Hypocrea virens)是一种抑制多种土传植物病原真菌的重寄生菌，菌落生长快，培养4天后直径7～9.5cm，气生菌丝卷毛状，白色或者灰色。分生孢子丰富，近于平展状覆盖于平板。克里本类芽孢杆菌作为植物病害生物防治的主要机制，已经越来越受到各国植物病理学家的重视。重寄生菌作为生物防治的重要因子，对于防治植物病害具有重要作用。现有技术中，关于克里本类芽孢杆菌发酵工艺的报道较少，仅专利号为CN 103756931 A的专利技术专利记载了关于克里本类芽孢杆菌的发现和应用的相关内容，克里本类芽孢杆菌培养方法和培养基仅是对克里本类芽孢杆菌的活化培养及活化培养基两方面有记载，并未就克里本类芽孢杆菌发酵方法以及发酵各阶段所使用的培养基有记载。克里本类芽孢杆菌活化培养方法无法满足本领域预防植物病害的应用，而传统的真菌发酵方法能够实现工业化生产，但存在发酵时间长，成本高，收率低等问题，不能满足现有防止植物病害的应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于得到优化的发酵生产方法，能够得到一种更高效的控制手段，最终获取孢子含量较高的克里本类芽孢杆菌粉。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法，包括下列步骤：1)将克里本类芽孢杆菌菌种活化，接种到一级液体培养基中进行一级培养，得到一级种子液；2)将所述步骤1)得到的一级种子液接种到二级液体培养基进行二级发酵培养，得到二级种子液；3)将所述步骤2)得到的二级种子液接种到三级液体培养基进行三级发酵培养，浓缩分离后，得到克里本类芽孢杆菌菌粉；所述三级液体培养基包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水。优选的，所述步骤1)中一级培养的时间为28～32h，一级培养的温度为28～32℃。优选的，所述步骤1)中一级培养须进行光照培养，所述光照培养的光强3000～4000xl。优选的，所述步骤1)中的一级培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：进入培养24h内，通气量为10～20m3/h，培养24h后，通气量15～24m3/h；优选的，所述培养的接种量为1.5～2.5％。优选的，所述一级培养的初始pH值为7.0～8.0。优选的，所述步骤1)中的一级培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min，所述搅拌的转速为150～300r/min。优选的，所述步骤2)中二级发酵培养的时间为45～52h，二级发酵培养温度为30～35℃。所述二级发酵培养在光照下进行，所述光照的光强为4000～5000xl。优选的，所述二级发酵培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：进入二级发酵培养后24h之内，通气量控制在100～180m3/h，培养24h后，通气量为200～260m3/h。优选的，所述二级发酵培养的接种量为7～15％。优选的，所述二级发酵培养的初始pH为7.0～8.0。优选的，所述步骤2)中的二级发酵培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min(专利技术人需确认)，所述搅拌的转速为150～300r/min。优选的，所述步骤3)三级发酵培养的时间为62～67h，三级发酵培养的温度28～32℃。所述三级发酵培养在光照下进行，所述光照的的光强为5000～7000xl。优选的，所述三级发酵培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：进入三级发酵培养后36h之内，通气量控制在1800～2300m3/h，培养48h后，通气量为800～1200m3/h。优选的，所述三级发酵培养的接种量为7～15％。优选的，所述三级发酵培养的初始pH值为7.0～8.0。优选的，所述步骤3)中的三级发酵培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min，所述搅拌的转速为150～300r/min。优选的，其特征在于，所述一级液体培养基包括下列质量百分含量组分：蔗糖2～5％、硝酸钠0.1～0.2％、磷酸氢二钾0.08～0.2％、硫酸镁0.03～0.1％、氯化钾0.02～0.1％、硫酸铁0.001～0.003％，余量为水；更优选的，所述一级液体培养基包括下列百分含量组分：蔗糖3％、硝酸钠0.15％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％、硫酸铁0.001％，余量为水。优选的，所述二级液体培养基包括下列质量百分含量组分：蔗糖1.00～2.00％、葡萄糖1.00～2.00％、黄豆粉0.70～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水；更优选的，所述二级液体培养基包括下列百分含量组分：蔗糖1.5％、葡萄糖1.5％、黄豆粉1％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钾0.05％、氯化钙0.1％，余量为水。本专利技术还提供了一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产用培养基，包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水。优选的，包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.5％、玉米粉1％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钾0.05％、氯化钙0.1％，余量为水。本专利技术提供了一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法，将克里本类芽孢杆菌菌种活化，在一级种子液体培养基和二级液体培养基进行培养以扩大繁殖，得到强健的菌体和一定量的孢子，将二级种子液接种到复合的碳源和氮源形成的三级液体培养基上，使克里本类芽孢杆菌的快速生长和产芽孢。得到的发酵液中活菌数为10-50亿CFU/ml，喷雾干燥后，得到菌粉的收率为10％-15％。由此可见，采用本专利技术的技术方案最终获取孢子含量较高的克里本类芽孢杆菌粉，解决了本专利技术的技术问题。附图说明图1为本专利技术实施例中三级发酵菌液处理流程图。菌种保藏克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)，包藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国.北京.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物所，保藏机构简称：CGMCC，保藏日期为2013年8月13日，保藏编号CGMCC No.7996，菌株编号：TRCC82001。具体实施方式本专利技术提供了一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法，包括下列步骤：1)将克里本类芽孢杆菌菌种活化，接种到一级液体培养基中进行一级培养，得到一级种子液；2)将所述步骤1)得到的一级种子液接种到二级液体培养基进行二级发酵培养，得到二级种子液；3)将所述步骤2)得到的二级种子液接种到三级液体培养基进行三级发酵培养，浓缩分离后，得到克里本类芽孢杆菌菌粉；所述三级液体培养基包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水。本专利技术提供了一种克本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法，其特征在于，包括下列步骤：1)将克里本类芽孢杆菌菌种活化，接种到一级液体培养基中进行一级培养，得到一级种子液；2)将所述步骤1)得到的一级种子液接种到二级液体培养基进行二级发酵培养，得到二级种子液；3)将所述步骤2)得到的二级种子液接种到三级液体培养基进行三级发酵培养，得到克里本类芽孢杆菌菌粉；所述三级液体培养基包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水。

【技术特征摘要】
1.一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法，其特征在于，包括下列步骤：1)将克里本类芽孢杆菌菌种活化，接种到一级液体培养基中进行一级培养，得到一级种子液；2)将所述步骤1)得到的一级种子液接种到二级液体培养基进行二级发酵培养，得到二级种子液；3)将所述步骤2)得到的二级种子液接种到三级液体培养基进行三级发酵培养，得到克里本类芽孢杆菌菌粉；所述三级液体培养基包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水。2.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述步骤1)中一级培养的时间为28～32h，一级培养的温度为28～32℃；所述一级培养在光照下进行，所述光照的光强为3000～4000lx；所述步骤1)中的一级培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：进入培养24h内，通气量为10～20m3/h，培养24h后，通气量为15～24m3/h；所述一级培养的接种量为1.5～2.5％；所述一级培养的初始pH值为7.0～8.0；所述步骤1)中的一级培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min，所述搅拌的转速为150～300r/min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中二级发酵培养的时间为45～52h，二级培养的温度为30～35℃；所述二级培养在光照下进行，所述光照的光强为4000～5000lx；所述二级发酵培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：进入二级培养后24h之内，通气量控制在100～180m3/h，培养24h后，通气量为200～260m3/h；所述二级发酵培养的接种量为7～15％；所述二级发酵培养的初始pH为7.0～8.0；所述步骤2)中的二级发酵培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min，所述搅拌的转速为150～300r/min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)三级发酵培养的时间为62～67h，培养的温度28～32℃；所述三级发...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗双燕，李英武，罗建辉，梁小文，王根豪，严艺波，李肖宇，吴俊杰，石峥，曾升华，石仕福，
申请(专利权)人：江西天人生态股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36