一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法及培养基技术

本发明专利技术公开一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法以及培养基，所述用于芽孢杆菌的高密度培养方法包括以下步骤：S1、菌种的驯化；S2、摇瓶种子培养；S3、种子罐种子培养；S3、发酵罐高密度发酵培养。所述发酵培养基础培养基的成分包括蛋白胨，酵母浸粉，葡萄糖，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰，氯化钙，豆粕。所述发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液；所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量3-4%所述用于芽孢杆菌的高密度培养方法适用于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的高密度培养。采用本发明专利技术所提供的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其发酵液中芽孢杆菌的芽孢形成率可在90%以上，芽孢密度最低在120亿/毫升以上。

【技术实现步骤摘要】
一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法及培养基
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法及培养基。
技术介绍
实践证明，随着抗生素饲料添加剂的使用，在抑制病原菌的同时，也抑制了动物消化道内的正常菌群，破坏了菌群的生态平衡，使得致病菌大量增殖，引发二次感染或内源性感染。而且，抗生素的频繁大量使用，会引起耐药菌株的产生，增加动物的易感性，造成免疫机能的减退而引发肠道疾病及其由此造成的环境污染。此外，抗生素的残留也极大的威胁人类健康，其防病、治病的效果也越来越不理想。因此，各国纷纷通过立法手段禁止或限制使用抗生素，研发出能代替抗生素的新型饲料添加剂成为发展的必然趋势。微生物饲料添加剂因其安全性、无毒、物残留及有利于生态环境的可持续发展成为抗生素替代品的首选，而芽孢杆菌是微生物制剂中应用最广泛的一种微生物制剂。近年来许多研究发现，芽孢杆菌对动物和人的病原菌具有显著的拮抗作用，芽孢杆菌的芽孢具有耐热、抗干燥、便于运输和使用等优点。在西方国家芽孢杆菌已开始应用于人的功能食品和动物饲料添加剂。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中的一种，革兰氏阳性需氧菌，是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，因其无毒、无残留、无污染，同时具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，对改善动物消化道微环境、促进动物营养的消化吸收、提高动物饲料的转化率和增强畜禽免疫力起到重要作用，以被越来越多的研制成动物饲料添加剂，广泛应用于畜牧业、饲料等行业。但是，目前对枯草芽孢杆菌的研究主要集中在抑菌作用、抑菌物质的分离纯化与表征、以及枯草芽孢杆菌的产酶特点和在豆柏中的应用效果研究等，而在提高枯草芽孢杆菌菌体产量的发酵技术方面、高密度培养工艺则报道较少。国内外文献报道的芽孢杆菌培养技术，发酵液芽孢密度多数在30-100亿/毫升之间，生产水平较低。如，湖南省微生物研究所(公布号CN 102433283 A)所述枯草芽孢杆菌ACCC10619的发酵培养培养方法，采用葡萄糖、淀粉、酵母粉、蛋白胨、豆饼粉、无机盐等作为培养基，只在30升发酵罐上进行试验，最高活菌数为150亿/毫升(没有说明是芽孢)。福州大学(公布号CN 102586153 A)所述的发酵培养方法，采用蛋白胨，可溶性淀粉，无机盐等作为培养基，发酵液芽孢浓度最高只有43亿。因此，现有的高密度发酵培养技术在实际培养时芽孢密度不高，不适合推广使用，生产成本高。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法及培养基，旨在解决现有高密度发酵培养技术培养芽孢杆菌时所得芽孢密度不高的问题。本专利技术的技术方案如下: 一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，包括如下步骤: 51、菌种的驯化:将斜面保存的菌种用生理盐水稀释后经80°C水浴热处理5~20分钟后，涂布在LB平板培养基上，30-37° C培养24~72小时；挑取单菌落于生理盐水中再经80° C水浴热处理5~20分钟，涂布在LB平板培养基上；重复上述步骤一次； 52、摇瓶种子培养； 53、种子罐种子培养； S3、发酵罐高密度发酵培养:按照5-10%的接种量将二级种子罐种子液转入发酵罐的发酵培养基础培养基，在温度30-37° C，搅拌130-230转/分钟条件下进行发酵；发酵至培发酵培养基础培养基的残糖含量在1%以下，用发酵培养基补充培养基补糖，所述发酵培养基补充培养基补糖在发酵前9小时内补完，补糖后培养液中的残糖控制在2%以下；当发酵液PH值低于6.0时用碱液将PH调节到7.0-7.5范围内，直到发酵结束； 其中，所述发酵培养基础培养基的成分包括:蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2飞克/升，磷酸二氢钾2飞克/升，硫酸镁0.6^0.7克/升，硫酸锰0.3-0.7克/升，氯化钙0.r0.3克/升，豆柏0-10克/升； 所述发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液；所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量3-4%。所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，步骤S2中，具体包括以下步骤: 将经过驯化后的菌种接种到一级摇瓶培养基，在30-37° C，150-250转/分钟的条件下摇瓶培养30-36小时，摇瓶结束后，种子液在7(T90°C水浴中热处理3-7分钟； 按2~15%的接种量将一级摇瓶种子液接入二级摇瓶培养基中，在30-37° C，150-250转/分钟的条件下摇瓶培养6~15小时。所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，，步骤S3中，具体包括以下步骤: 按照1-3%的接种量将二级摇瓶种子液接种到一级种子罐，在30-37° C，搅拌130-230转/分钟条件下培养6-10小时，至0D600值达到8-12或以上时，转入二级种子罐培养；按照3-10%的接种量将一级种子罐种子转入二级种子罐，在30-37° C，130-230转/分钟条件下培养4-12小时，至0D600值达到10-16或以上时，转入发酵罐进行发酵培养； 所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，，步骤S2中，所述一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，PH为7.0-7.5 ；所述二级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，PH值为7.0-7.5。所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，，步骤S3中，所述一级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，所述一级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5 ； 所述二级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2飞克/升，磷酸二氢钾2飞克/升，硫酸镁0.6^0.7克/升，硫酸锰0.3^0.7克/升，·氯化钙0.r0.3克/升，豆柏0-10克/升，所述二级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5。所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。一种用于芽孢杆菌的培养基，其中，所述用于芽孢杆菌的培养基包括发酵培养基础培养基和发酵培养基补充培养基；其中，蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3-0.7克/升，氯化钙0.1、.3克/升，豆柏0-10克/升;ph值在7.0-7.5内；所述发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液；所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量3-4%。所述的用于芽孢杆菌的培养基，其中，所述用于芽孢杆菌的培养基，还包括一级摇瓶培养基二级摇瓶培养基和二级摇瓶培养基；所述一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，PH为7.0-7.5 ；所述二级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，PH值为7.0-7.5。所述的用于芽孢杆菌的培养基，其中，所述用于芽孢杆菌的培养基，还包括一级种子罐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、菌种的驯化：将斜面保存的菌种用生理盐水稀释后经80°C水浴热处理5~20分钟后，涂布在LB平板培养基上，30?37°C培养24~72小时；挑取单菌落于生理盐水中再经80°C水浴热处理5~20分钟，涂布在LB平板培养基上；重复上述步骤一次；S2、摇瓶种子培养；S3、种子罐种子培养；S3、发酵罐高密度发酵培养：按照5?10%的接种量将二级种子罐种子液转入发酵罐的发酵培养基础培养基，在温度30?37°C，搅拌130?230转/分钟条件下进行发酵；发酵至培发酵培养基础培养基的残糖含量在1%以下，用发酵培养基补充培养基补糖，所述发酵培养基补充培养基补糖在发酵前9小时内补完，补糖后培养液中的残糖控制在2%以下；当发酵液PH值低于6.0时用碱液将PH调节到7.0?7.5范围内，直到发酵结束；其中，所述发酵培养基础培养基的成分包括：蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3?0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0?10克/升；?所述发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液；所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量3?4%。...

【技术特征摘要】
1.一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，包括如下步骤: 51、菌种的驯化:将斜面保存的菌种用生理盐水稀释后经80°C水浴热处理5~20分钟后，涂布在LB平板培养基上，30-37° C培养24~72小时；挑取单菌落于生理盐水中再经80° C水浴热处理5~20分钟，涂布在LB平板培养基上；重复上述步骤一次； 52、摇瓶种子培养； 53、种子罐种子培养； S3、发酵罐高密度发酵培养:按照5-10%的接种量将二级种子罐种子液转入发酵罐的发酵培养基础培养基，在温度30-37° C，搅拌130-230转/分钟条件下进行发酵；发酵至培发酵培养基础培养基的残糖含量在1%以下，用发酵培养基补充培养基补糖，所述发酵培养基补充培养基补糖在发酵前9小时内补完，补糖后培养液中的残糖控制在2%以下；当发酵液PH值低于6.0时用碱液将PH调节到7.0-7.5范围内，直到发酵结束； 其中，所述发酵培养基础培养基的成分包括:蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2飞克/升，磷酸二氢钾2飞克/升，硫酸镁0.6^0.7克/升，硫酸锰0.3-0.7克/升，氯化钙0.r0.3克/升，豆柏0-10克/升； 所述发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液；所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量3-4%。2.根据权利要求1所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，步骤S2中，具体包括以下步骤: 将经过驯化后的菌种接种到一级摇瓶培养基，在30-37° C，150-250转/分钟的条件下摇瓶培养30-36小时，摇瓶 结束后，种子液在7(T90°C水浴中热处理3-7分钟； 按2~15%的接种量将一级摇瓶种子液接入二级摇瓶培养基中，在30-37° C，150-250转/分钟的条件下摇瓶培养6~15小时。3.根据权利要求1所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，步骤S3中，具体包括以下步骤: 按照1-3%的接种量将二级摇瓶种子液接种到一级种子罐，在30-37° C，搅拌130-230转/分钟条件下培养6-10小时，至0D600值达到8-12或以上时，转入二级种子罐培养；按照3-10%的接种量将一级种子罐种子转入二级种子罐，在30-37° C，130-230转/分钟条件下培养4-12小时，至0D600值达到10-16或以上时，转入发酵罐进行发酵培养。4.根据权利要求2所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，步骤S2中，所述一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，PH 为 7.0-7.5 ； 所述二级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/...

【专利技术属性】
技术研发人员：付幸福，周玉岩，逯佩凤，曾文年，周俊超，
申请(专利权)人：广东海纳川药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：