一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用，该制备方法包括以下步骤：A、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液浓缩，向浓缩液中加入β环糊精、糊精、阿拉伯胶进行乳化5-10分钟；B、将混合液输入高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，制得半成品颗粒；C、利用硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、丙三醇构成的包衣液在流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，制得成品。，发明专利技术制备方法工艺简单，成本低廉，可进行大批量规划化生产。且通过本发明专利技术的方法制备的抗菌肽制剂包封率高，稳定性好，从而提高了抗菌肽在饲料加工及储存中的稳定性和货架期，也减少了饲料投料时抗菌肽在水体中的溶失，提高了抗菌肽利用率、减少了对水体的污染。

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用。
技术介绍
抗菌肽(antimicrobialpeptides，AMPs)是动物先天性免疫的重要组成部分，是动植物防御微生物入侵的第一道屏障，具有广谱的抗菌作用，它们对革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌都有杀灭作用，而且有效作用浓度极低，有些甚至在nmol浓度下就可完全抑制细菌的生长。与传统抗生素相比，抗菌肽最大的特点在于其杀菌机理是疏水性端螺旋直接插入细菌菌胞膜内而造成孔道，将细菌内容物泄出外而死亡，作用迅速，对耐药菌有效且细菌不易产生耐药性。抗菌肽在现行养殖条件下替代抗生素实验数据表明，可有效提高动物抗病能力，促进动物生长,因而抗菌肽具有广泛的应用前景，但由于抗菌肽自身的组成特点，在与其他原料混合、制粒过程中，抗菌肽的生物学活性会受到其他原料中多种微量元素、酸、外源酶等的极大影响，同时制粒过程中瞬时高温过程也会大大影响其生物学活性；另外抗菌肽在水体中易溶失，大大降低了其使用效果。为提高抗菌肽的稳定性，通常利用目前通用的多肽制备技术将抗菌肽制备为肠溶包衣制剂、胶囊、微丸、微乳、脂质体、微粒、纳米粒等剂型，但微乳、复乳制剂在包封率与稳定性方面较差，无法满足抗菌肽的包封要求，而脂质体的局限在于药物用量大、包封率低、稳定性不佳，也不满足抗菌肽制剂的制备要求。而肠溶包衣制剂、微粒、微囊和纳米粒又存在制备工艺复杂，成本较高，不适于大批量规模化生产的问题，同样不适用抗菌肽制剂的制备。因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用，旨在解决目前对于抗菌肽制剂制备技术包封率低，稳定性差，成本高的问题。本专利技术的技术方案如下：一种抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：A、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液进行浓缩，向浓缩液中加入β环糊精、糊精、阿拉伯胶进行乳化混合5-10分钟；B、将混合液输入高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，制得半成品颗粒；C、利用硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、丙三醇构成的包衣液在流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，制得成品。所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述抗菌肽产生菌为毕赤酵母重组菌GS115/pPicZaMF57-PLE118，该抗菌肽的氨基酸序列为：GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述步骤A具体为：A1、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液浓缩，形成固含量为30-40%的浓缩液；A2、向浓缩液中加入质量分数10-20%的β环糊精、质量分数1-2%的糊精、质量分数5-10%的阿拉伯胶后利用高剪切乳化泵在2000-3000转/分钟的条件下混合5-10分钟。所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述高速离心喷雾干燥机的设定条件为：雾化盘转速为3000-5000转/分钟、进风温度为140-160℃，混合液的进料量为800-1100千克/小时。所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，利用震荡筛收集对喷雾干燥后形成的半成品颗粒进行筛分，控制所收集的半成品颗粒粒径范围为350-850μm。所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述包衣液是由质量分数为80-90%的硬脂酸、质量分数9-18%的单硬脂酸甘油酯及质量分数为1-2%的丙三醇组成。所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述步骤C具体为：C1、将筛分合格后的半成品颗粒输入到流化床包衣机中，每次装料量为200kg；C2、将包衣液的加热至70-100℃进行融化，并将融化好包衣液利用保温泵泵入流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，其中，控制流化床包衣机中包衣液喷雾速度为200-300克/分钟，进风温度为16-20℃，出风温度为30-40℃。所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，融化好的包衣液暂存于包衣液配料罐中，包衣处理时，通过保温泵将包衣液配料罐中的包衣液泵入流化床包衣机，其中，该包衣液配料罐在包衣处理过程中始终进行加热保温，使包衣液温度始终保持在70-80℃。一种抗菌剂制剂，其中，所述抗菌剂制剂采用如上所述的方法制备得到。一种如上所述的抗菌剂制剂的应用，其中，所述抗菌剂制剂用作畜禽饲料添加剂或水产饲料添加剂。有益效果：本专利技术提供一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用，相较于使用传统的微粒、微囊、纳米粒、纳米囊技术包封抗菌肽，本专利技术制备方法工艺更加简单，成本低廉，可进行大批量规划化生产。且通过本专利技术的方法制备的抗菌肽制剂包封率高，稳定性好，从而提高了抗菌肽在饲料加工及储存中的稳定性和货架期，也减少了饲料投料时抗菌肽在水体中的溶失，提高了抗菌肽利用率、减少了对水体的污染。具体实施方式本专利技术提供一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术本专利技术提供一种抗菌肽制剂的制备方法，其中所使用的用于产生抗菌肽的抗菌肽产生菌为毕赤酵母重组菌GS115/pPicZaMF57-PLE118，该重组菌的构建过程如下：重组质粒构建及筛选转化：根据酵母外源蛋白表达密码子偏好性对菌丝霉素核苷酸序列进行优化及人工合成。将人工合成的菌丝霉素核苷酸序列连接到pUC57的Aval和BamHI酶切位点间，构建成含有菌丝霉素目的基因的重组质粒pUC57-plectasin，其中菌丝霉素核苷酸序列为:GGTTTTGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCAATGTCATAACCATTGTAAGTCTATTAAGGGTTACAAGGGTGGTTACTGTGCTAAGGGTGGTTTTGTTTGTAAGTGTTAC。用Aval和BamHI双酶切重组质粒pUC57-Plectasin得到菌丝霉素基因片段并连接到毕赤酵母表达载体pPicZaMF57(一种α-因子信号肽突变体)的多克隆位点（Aval和BamHI），并位于α因子信号肽序列的下游，构建成含有菌丝霉素目的基因的重组表达载体pPicZaMF57-plectasin。毕赤酵母重组菌构建、筛选及鉴定：重组表达载体pPicZaMF57-Plectasin经Pme1酶酶切线性后,用电转仪电击转化进入到到毕赤酵母GS115中,用含0.5-1mg/mlZeocin(博莱霉素)的YPD培养基筛选，30℃培养2～3d，筛选出阳性多拷贝转化子，初步确定菌丝霉素基因序列重组到毕赤酵母染色体组上。将上述筛选得到的多个阳性转化子分别接种于含2mlBMGY培养基中的20ml的离心管中，30℃下220r/mim摇床培养24h。将1ml菌体转移至10mlBMMY诱导培养基中，30℃下200r/mim摇床继续培养，每24h补加100ul100％甲醇。每24h取样，将培养基于5000r/mim离心5min，收集上清，对上清进行抗菌活性检测；同时对初步筛选得到的阳性转化子进行菌丝霉素目的基因PCR扩增分子鉴定。根据上述抗菌活性检测及PCR扩增分子鉴定结果，将抗菌活性最优且含有菌丝霉素目的基因的菌丝霉素重组毕赤酵母菌株命名为GS115/pPicZaMF57-PLE118。而该菌种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：A、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液进行浓缩，向浓缩液中加入β环糊精、糊精、阿拉伯胶进行乳化混合5‑10分钟；B、将混合液输入高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，制得半成品颗粒；C、利用硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、丙三醇构成的包衣液在流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，制得成品。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：A、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液进行浓缩，向浓缩液中加入β环糊精、糊精、阿拉伯胶进行乳化混合5-10分钟；B、将混合液输入高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，制得半成品颗粒；C、利用硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、丙三醇构成的包衣液在流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，制得成品；根据酵母外源蛋白表达密码子偏好性对菌丝霉素核苷酸序列进行优化及人工合成，将人工合成的菌丝霉素核苷酸序列连接到pUC57的Aval和BamHI酶切位点间，构建成含有菌丝霉素目的基因的重组质粒pUC57-plectasin，其中菌丝霉素核苷酸序列为:GGTTTTGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCAATGTCATAACCATTGTAAGTCTATTAAGGGTTACAAGGGTGGTTACTGTGCTAAGGGTGGTTTTGTTTGTAAGTGTTAC；用Aval和BamHI双酶切重组质粒pUC57-Plectasin得到菌丝霉素基因片段并连接到毕赤酵母表达载体pPicZaMF57的多克隆位点，并位于α因子信号肽序列的下游，构建成含有菌丝霉素目的基因的重组表达载体pPicZaMF57-plectasin；所述抗菌肽产生菌为毕赤酵母重组菌GS115/pPicZaMF57-PLE118，该抗菌肽的氨基酸序列为GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：逯佩凤，周玉岩，代珍青，闫凯，叶滔，
申请(专利权)人：广东海纳川药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44