一种橙皮苷酶的生产方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种橙皮苷酶的生产方法及应用，生产方法包括以下步骤：1）、将黑曲霉在麸皮培养基中进行产孢培养形成黑曲霉孢子；2）、黑曲霉孢子在产酶培养基中进行发酵产酶生产橙皮苷酶；3）、分离提取获得酶液；所述黑曲霉保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为KH005，其保藏号为：CGMCC12101。本发明专利技术通过采用黑曲霉KH005在产酶发酵培养基中生产的橙皮苷酶具有酶活高、热稳定性好的优点。将本发明专利技术所述的黑曲霉KH005应用于酶解法生产橙皮素，为橙皮素的生产提供了新的工艺选择，酶解法反应条件温和，选择性好，橙皮苷母环不易变性，且生产的橙皮素含量高易分离。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵领域，具体涉及一种橙皮苷酶的生产方法及应用。
技术介绍
橙皮苷酶是水解橙皮苷关键酶，具有很高的应用价值。利用橙皮苷酶水解橙皮苷可以得到橙皮素单糖苷、橙皮素、鼠李糖和葡萄糖。此外将橙皮苷酶添加到桔瓣罐头中，水解其中的橙皮苷，可以防止柑桔罐头产生白色沉淀。橙皮苷酶可由多种微生物产生，如青霉菌、米曲霉、黑曲霉和拟杆菌属等。目前国内关于产橙皮苷酶菌株的研究还比较少，已有报道的产橙皮苷酶的菌株多为霉菌。在现有采用霉菌生产橙皮苷酶的方法中，由于生产的橙皮苷酶的酶活低、热稳定性差导致生产橙皮苷酶成本比较高，很难达到工业化生产的要求。而橙皮苷酶的酶活的高低与热稳定性的优劣与菌株的选择、培养方法和发酵条件等有关，进而，选择具有优势的菌株，以及设计合适的培养方法和发酵条件是生产酶活高、热稳定性好的橙皮苷酶的关键。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种反应条件温和、选择性好、工艺简单优化的橙皮苷酶的生产方法，解决现有橙皮苷酶的酶活低、酶热稳定性差的问题。此外，本专利技术还涉及橙皮苷酶的应用。本专利技术通过下述技术方案实现：一种橙皮苷酶的生产方法，包括以下步骤：1)、将黑曲霉在培养基中进行产孢培养形成黑曲霉孢子；2)、黑曲霉孢子在产酶培养基中进行发酵产酶生产橙皮苷酶；3)、分离提取获得酶液；所述黑曲霉保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为KH005，其保藏号为：CGMCC12101。现有的橙皮苷酶的在生产方法通产是采用微生物(主要是指霉菌和真菌)降解橙皮苷获得，虽然能生产橙皮苷酶的菌株有很多，但是现有发现的菌株产橙皮苷酶的能力弱，即生产的橙皮苷酶的酶活低，且橙皮苷酶的热稳定性差，影响橙皮苷酶的酶活和热稳定性的因素除了菌株的选择外，还与发酵反应条件有关。本申请人通过多次试验，发现了一株新的黑曲霉菌株KH005，将其通过本专利技术所述工艺步骤生产的橙皮苷酶的效率高，生产的橙皮苷酶的酶活高、热稳定性好；橙皮苷酶的酶活的测定过程如下：试管中加入5mlpH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液、4.5ml浓度为0.2％的橙皮苷底物溶液，在45℃水浴下保温5min，然后加入，0.5ml上述粗酶液，充分摇匀，准确计时，45℃反应20min，再迅速移入沸水浴中灭活10min，采用高效液相色谱法测得剩余底物量，得出底物减少量，从而测出酶活。计算公式如下:粗酶液的酶活力(U/ml)＝(b-a)/(20×0.5)；其中，a(μg)为酶解后剩余底物含量；b(μg)为反应前的底物含量。测定结果表明该粗酶液橙皮苷酶活性为2349-2647U。对于酶活的计算方式主要包括两种：一种是按照液体体积计算U/ml；另一种是按照所投原料的质量计算U/g，本专利技术所述的酶活经过优化后3-4天酶活(按照液体体积计算U/ml)便可以达到2000U以上，如果按照所投原料的质量计算，我们的菌株酶活可以达到80000U/g以上。橙皮苷酶的酶活定义:在45℃、pH4.5的条件下,每分钟转化1微克橙皮苷底物所需的酶量为一个酶活力单位(U)。酶活的定义不同文章或者专利有一定的差异，但是我们酶活的定义采用的是目前比较公认的一种定义。可以参见文献(申丽静，汪钊.橙皮苷酶的制备及其催化性质的研究[D].浙江工业大学，2006:63；孟娜，魏胜华，郑长龙.黑曲霉发酵产橙皮苷酶的工艺优化[J].生物技术，2011,21(2):77-80)。并且，对制备的粗酶液中的橙皮苷酶的热稳定性进行测定：通过将橙皮苷酶置于一定温度下进行培养，每隔一段时间测量橙皮苷酶的酶活，以最初的橙皮苷酶的酶活进行比较来判断橙皮苷酶的热稳定性，申请人通过实验证明：通过本专利技术所述的黑曲霉KH005生产的橙皮苷酶的热稳定性好：在50-55℃条件下反应72h后，酶活可以保存50％左右；在60-65℃条件下反应24h酶活依然可以保存50％左右，即在50-55℃条件下，酶的半衰期为72h,在60-65℃条件下半衰期为24h，而现有的菌株所产酶的热稳定性较差，当在大于45℃的水浴中处理30min左右，酶活便出现了明显的下降，超过2h酶基本失活。本专利技术中涉及保藏的黑曲霉的保藏信息如下：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年1月25日；保藏编号：CGMCC12101，保藏名称为KH005；分类命名：Aspergillusniger。黑曲霉菌株KH005的获得：黑曲霉是以枳实(通过市场购买获得)为原料，在培养基中经过初筛选挑选出产橙皮苷酶能力大的菌株，将初筛选出的菌株在培养基中经过多次转接筛选获得。黑曲霉KH005的筛选过程：1)、培养基的制备：将2.0g硝酸钠、0.05g氯化钾、1.0g磷酸二氢钾、18.0g橙皮苷、20.g琼脂溶解与1L蒸馏水中，并用1M的盐酸调pH为6.0-6.5，分装三角瓶，121℃灭菌15min，待培养基冷至50-55℃时，倒平板，冷却后备用。2)、菌株的初筛：无菌条件下取20克枳实于装有200mL无菌水三角瓶中，置揺床上室温振荡30分钟。取菌液按10倍的梯度稀释到10-6，取各稀释度菌液1mL放入无菌平皿中，倒入灭菌后冷却至50℃的培养基，混匀，待凝固后放入30℃培养箱培养5天，观察菌落周围透明圈的大小进行初筛，挑取有透明圈的菌株保经进一步纯化后保存到斜面培养基；然后将纯化后的菌株接种到平板培养基上培养5天，测量透明圈的直径，结果如表1所示。因为橙皮苷酶分解橙皮苷产生在菌落周围形成透明圈，所以通过透明圈的大小可以初步判断菌株产橙皮苷酶能力的大小。挑选菌落周围有透明圈的单菌落保存。初筛得到的菌株经形态观察发现均为霉菌。表1初筛得到菌株的菌落形态及透明圈直径3)、菌株的复筛：将初筛的菌株经过多次转接后发现，大部数菌株菌落生长逐渐变得缓慢，形成的透明圈也越来越小。经过多代筛选，最终获得了一株生长迅速、色素少且产橙皮苷酶能力稳定的菌株KH005，根据形态初步鉴定为霉菌。KH005菌株的鉴定：1)、DNA提取：收集菌体，溶于5mL提取缓冲液(100mMTris·Cl，100mMNa2EDTA，200mMNaCl，2％CTAB，pH8.0)中，37℃振荡45min。加入0.75mL20％SDS，65℃水浴1h。12,000rpm，离心10min，收集上清。上清用等体积的酚：氯仿：异戊醇...

【技术保护点】
一种橙皮苷酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、将黑曲霉在培养基中进行产孢培养形成黑曲霉孢子；2)、黑曲霉孢子在产酶培养基中进行发酵产酶生产橙皮苷酶；3)、分离提取获得酶液；所述黑曲霉保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为KH005，其保藏号为：CGMCC12101。

【技术特征摘要】
1.一种橙皮苷酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、将黑曲霉在培养基中进行产孢培养形成黑曲霉孢子；
2)、黑曲霉孢子在产酶培养基中进行发酵产酶生产橙皮苷酶；
3)、分离提取获得酶液；
所述黑曲霉保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏
名称为KH005，其保藏号为：CGMCC12101。
2.根据权利要求1所述的一种橙皮苷酶的生产方法，其特征在于，所述培
养基由以下重量份组分组成：小麦麸皮100g，蒸馏水70ml。
3.根据权利要求1所述的一种橙皮苷酶的生产方法，其特征在于，所述产
孢培养是指将孢悬液黑曲霉接种到培养基中，在30～35℃条件下培养6～7天。
4.根据权利要求1所述的一种橙皮苷酶的生产方法，其特征在于，所述产
酶培养基由以下重量百分比的组分组成：0.2％NaNO3，0.005％KCl，0.1％
K2HPO4，0.05％MgSO4.7H2O，橙皮苷0.5％，麸皮2％，余量为蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的一种橙皮苷酶的生产方法，其特征在于，所述发
酵产酶是指黑曲霉孢子接种...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文清，魏勇，冯唯成，
申请(专利权)人：成都康辉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51