一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法技术

本发明专利技术公开了一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法，包括以下步骤，1)脂肪干细胞的分离培养和纯化；2)脂肪干细胞的传代培养；按照本发明专利技术方法所得到的脂肪干细胞遗传稳定性好，体外连续培养到15代仍然保持遗传稳定性；干性好，体外培养传代到第18代仍具有间充质干细胞表面抗原特性；多向分化性能好，具有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化的能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物细胞培养领域，尤其涉及一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法。
技术介绍
胚胎干细胞的研究遇到伦理、法律的瓶颈之后，成体干细胞日益成为研究的热点。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是存在于脐带血、骨髓、肌肉、皮肤和脂肪等组织中的一类成体干细胞，MSCs来源可靠，具有自我更新，且具有向多种组织分化潜能，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。脂肪干细胞(Adipose-derivedstemcells，脂肪干细胞)是近年来从脂肪组织中分离得到的一类成体间充质干细胞，具有自我更新及向分化潜能。脂肪干细胞由于具有安全、易获得、可迅速扩增和多向分化能力等特点使其成为现有干细胞生物工程研究的最理想来源。目前临床上已利用这种细胞进行基因治疗、干细胞治疗及骨组织工程的修复等，在再生医学领域具有广泛的应用前景。2006年，国际细胞治疗协会(间充质干细胞委员会)(MesenchymalandTissueStemCellCommitteeoftheInternationalSocietyforCellularTherapy)认为人类的MSCs的必须满足以下三个条件：(1)在标准的细胞培养条件下，MSCs必须具备可贴壁性生长；(2)MSCs应该高表达CD73、CD90、CD105；而应低表达或不表达CD14、CD45、CD11b、CD34、CD79、CD19以及人白细胞抗原(HLA-DR)。(3)在特定的诱导液培养下，MSCs必须具有向骨、脂肪和软骨分化的能力。由于目前脂肪干细胞并没有特定的表面标志，因此对它们的鉴定主要采用流式细胞仪检测细胞表面标志和将脂肪干细胞进行成脂、成骨和成软骨的诱导分化来确定它们是否为脂肪干细胞。这是目前公认的间充质干细胞鉴定方法。在现有技术中，猪脂肪干细胞在体外连续培养后，容易老化，核型发生改变、表面抗原发生变化、且多向分化能力仅局限于向成骨或成骨和成脂肪细胞方向分化(Zhangetal.(2014).PLoSONE9(1)：e85089.doi：10.1371/journal.pone.0085089；Huangetal.StemCellResearch&Therapy(2015)6：77)，没有向成软骨细胞方向诱导成功的报道。脂肪干细胞的老化限制了其在脂肪组织工程及其他组织工程中研究和应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种遗传稳定性好，干性好，多向分化性能好的脂肪干细胞培养的方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤，细胞筛过滤后进行梯度离心，所述的细胞筛过滤和梯度离心重复两次，然后进行细胞培养，所述消化采用LiberaseTL进行，所述消化的温度为37℃，时间为1～3h；所述的LiberaseTL的浓度为15～25μg/mL，LiberaseTL与脂肪组织的体积比为0.5～1∶1；2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。优选的，步骤1)中所述的脂肪组织消化前还包括以下步骤：采集猪脂肪组织；将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液为含有0.45～0.5g/L青霉素和0.6～1.0g/L链霉素的PBS溶液。优选的，所述的脂肪组织消化后还包括终止消化，所述终止消化具体为：使用含体积分数为7.5～15％FBS的低糖DMEM培养液终止消化，所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。优选的，所述的细胞筛过滤按照时间顺序包括第一细胞筛过滤和第二细胞筛过滤；所述第一细胞筛过滤中细胞筛的孔径为100μm，所述第二细胞筛过滤中细胞筛的孔径为70μm。优选的，所述的梯度离心按照时间顺序包括第一离心和第二离心；所述第一离心的转速为1000～1400rpm，所述第一离心的时间为8～12min；所述第二离心的转速为8000～1200rpm，所述第二离心的时间为8～12min。优选的，所述传代培养采用的培养液为含有体积分数为7.5～15％％FBS的低糖DMEM培养液，所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。本专利技术还提供了一种猪脂肪干细胞的鉴定方法，包括以下步骤：将猪脂肪干细胞进行生物学特性鉴定、表面抗原检测和诱导分化检测。优选的，所述生物学特性鉴定包括测定生长曲线、测定细胞集落和分析细胞核型。优选的，所述脂肪干细胞表面抗原检测前还包括：将所述脂肪干细胞依次进行预消化和消化；所述预消化采用LiberaseTL进行，所述LiberaseTL的浓度为15～25μg/mL，所述预消化的温度为37℃，所述预消化的时间为1～3min，所述预消化的环境中的CO2的体积比例为5％，所述预消化的环境中的湿度为饱和湿度；所述消化采用胰蛋白酶和EDTA进行，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.25％，所述EDTA的质量浓度为0.03～0.05％，所述消化的温度为37℃，CO2饱和湿度为5％，所述消化的时间为1～3min。优选的，所述的脂肪干细胞诱导分化检测，包括以下步骤：培养猪脂肪干细胞，当细胞汇合度达到80％-90％时，加入成脂诱导液、成骨诱导液和成软骨诱导液进行为期2～4周的成脂、成骨和成软骨细胞诱导；将诱导培养到期的细胞分别进行油红O、茜素红和阿尔新蓝染色；将诱导培养到期的细胞进行成脂特异性基因Ppar-2、成骨特异性基因Osteocalcin和成软骨特异性基因CollagenII检测；所述的油红O、茜素红和阿尔新蓝染色和所述的成脂特异性基因Ppar-2、成骨特异性基因Osteocalcin和成软骨特异性基因CollagenII检测之间无时间顺序限定。本专利技术的有益效果：本专利技术提供方法所得到的脂肪干细胞体外连续培养到15代，细胞增殖力强，仍然保持遗传稳定性；所得到的脂肪干细胞干性好，体外培养传代到第18代仍具有间充质干细胞表面抗原特性(CD90+、CD44+、CD29+、CD105+、CD31-、CD45-和HLA-DR-)；尤其是不表达HLA-DR，说明脂肪干细胞无免疫排斥反应；所得到的脂肪干细胞的多向分化性能好，具有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化的能力。本专利技术的方法操作简单、方便实用、可重复性强，建立了一套规范标准的猪脂肪干细胞的分离、培养和鉴定的方法，为今后利用脂肪干本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤，细胞筛过滤后进行梯度离心，所述的细胞筛过滤和梯度离心重复两次，然后进行细胞培养，所述消化采用Liberase TL进行，所述消化的温度为37℃，时间为1～3h；所述的Liberase TL的浓度为15～25μg/mL，Liberase TL与脂肪组织的体积比为0.5～1∶1；2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。

【技术特征摘要】
1.一种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：
1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤，细胞筛过滤后进行梯度离心，
所述的细胞筛过滤和梯度离心重复两次，然后进行细胞培养，
所述消化采用LiberaseTL进行，所述消化的温度为37℃，时间为1～3h；
所述的LiberaseTL的浓度为15～25μg/mL，LiberaseTL与脂肪组织的体积比
为0.5～1∶1；
2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的脂肪组
织消化前还包括以下步骤：
采集猪脂肪组织；
将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液为含有
0.45～0.5g/L青霉素和0.6～1.0g/L链霉素的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪组织消化后还
包括终止消化，所述终止消化具体为：
使用含体积分数为7.5～15％FBS的低糖DMEM培养液终止消化，所述的
低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞筛过滤按照时
间顺序包括第一细胞筛过滤和第二细胞筛过滤；
所述第一细胞筛过滤中细胞筛的孔径为100μm，所述第二细胞筛过滤中
细胞筛的孔径为70μm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度离心按照时间
顺序包括第一离心和第二离心；
所述第一离心的转速为1000～1400rpm，所述第一离心的时间为8～12min；
所述第二离心的转速为8000～1200rpm，所述第二离心的时间为8～12min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传代培养采用的培养
液为含有体积分数为7.5～15％％FBS的低...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨素芳，韩杰，李海洋，邓彦飞，石德顺，朱鹏，杨海燕，韦精卫，李湘萍，黄奔，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45