一种提高肝素酶I活性的工程菌株构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。依照肝素酶I的空间结构分析对其氨基酸序列进行优化，获得比酶活提高48％的Hep169。然后根据密码子偏爱性优化HepI169基因，通过人工合成获得基因DNA，克隆到表达载体中与SUMO等标签进行融合表达，转化宿主细胞、筛选建立了Hep169的可溶性基因工程表达生产体系，分析结果显示目的蛋白获得了高效的可溶性表达，且具有很好的生物学活性，能高效的裂解肝素生成低分子量肝素。本发明专利技术方法不仅提供了一种高活性的HepI，而且为肝素酶I的高效可溶性基因工程表达生产提供了一种新方法，可有效降低低分子肝素等药物的生产成本，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，是一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。
技术介绍
肝素是动物体内一种天然抗凝血物质，一直被用做抗凝血的主要药物，并且研究表明除了抗凝血活性及其相关的抗血栓形成活性以外，肝素还具有抑制平滑肌细胞增殖、抗炎症、抗肿瘤和抗病毒等生物学功能。虽然肝素现仍用于临床治疗，但是其带来的副作用也越来越明显，例如肝素的长期使用容易引起大量出血，诱导血小板减少及血栓形成，影响血小板稳定及过敏反应等症状。而低分子量肝素以其注射吸收好、半衰期长、生物利用度高、出血副作用少等优点在临床上的应用不断扩大。截至目前为止，低分子量肝素已经逐步取代肝素成为了首选的治疗药物。低分子量肝素的生产可以分为化学降解法和酶解法。酶解法相对于化学降解法而言具有其独特的优点，例如作用条件温和，酶的专一性高，环境相对友好等，是较理想的工业生产低分子肝素的方法。但是利用酶解法生产低分子量肝素的缺点在于肝素酶(HepI)的来源有限，其野生菌产量很低并且需要价格昂贵的肝素进行诱导表达，从而导致生产成本过高。另一方面也是由于HepI的重组表达极易形成无活性的包涵体，并且不容易复性。我国是肝素原料的出口大国，但一直未能对低分子量肝素生产技术进行系统的研究。目前低分子量肝素主要来自合资企业生产或者由国外进口，因此，利用酶解法生产低分子量肝素的研究应用前景极为广泛。而HepI作为低分子量肝素酶法生产的原材料，其高效生产技术的研究则受到广泛关注。本研究采用融合表达HepI的形式来克服其容易形成包涵体的难题，同时结合生物信息学分析，对采取定点突变策略提高其酶活性，以达到其高效生产和利用的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服当前肝素酶活性低的而缺点，提供一种高活性HepI及其高效可溶性基因工程表达方法，本专利技术获得的工程菌可以可溶性表达高活性HepI，因此不但降低了包涵体在变复性过程中的酶活损失、缩短了生产工艺，降低了生产成本，便于更好的大规模工业化生产HepI，更能高效地用于低分子量肝素的工业化生产。本专利技术实现目的的技术方案如下：一种一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法，其特征在于：改造获得一种具有高活性的HepI突变体Hep169，然后利用分子生物学技术建立了它的高效可溶性基因工程表达体系。(1)依照HepI的空间结构分析，改造获得一种比酶活较野生型提高48％的高活性肝素酶Hep169；(2)针对宿主密码子偏爱性，对Hep169的编码基因进行优化，以大肠杆菌为例，其优化后的序列如附录序列表所示；(3)为实现高效可溶性基因工程表达，将Hep169与可促进二硫键形成、空间折叠的融合标签进行融合表达，这些融合标签包括SUMO、泛素、GST、Trx、DsbC、MBP等(4)为了确保融合标签不影响Hep169的空间结构及活性，在肝素酶I基因的N端引入柔性linker，可用的柔性linker包括(G4S)n(n＝1-4)、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG等。(5)为了在后续纯化中切去融合标签，在融合标签与Hep169间引入了蛋白酶切割位点，可用的蛋白酶包括肠激酶、SUMO蛋白酶、凝血酶、TEV酶、Xa因子、3C蛋白酶等；(6)将重组质粒转化至基因工程宿主菌，所述宿主菌包括大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等。(7)重组表达产物Hep169可高效裂解肝素生成低分子量肝素。本专利技术的有益效果和优点是：1、本专利技术的方法改造获得了一种酶活显著提高的HepI突变体Hep169，该突变体可明显提高低分子肝素的酶解制备效率、并降低成本。2、成功实现了HepI169的高效基因工程表达，避免了包涵体变复性过程中对酶活造成的损失、缩短了HepI的生产工艺流程，降低了生产成本。3、本专利技术的重组Hep169具有可溶性好，活性高等优点，可以极大地发挥其在工业上高效生产低分子量肝素的目的。附图说明(以SUMO融合的大肠杆菌表达质粒为例)图1为本专利技术重组质粒PCR验证图，泳道1是以pESUMO为模板做的PCR结果，作为阴性对照，泳道2是G4S柔性linker-肠激酶切割位点(DDDDK)-HepI的PCR结果，作为阳性对照，泳道3是以构建的重组质粒pESUMO-HepI为模板做的PCR结果。图2为HepI重组大肠杆菌的质粒提取验证图，泳道1是转入PESUMO空质粒的大肠杆菌；泳道2是转入pESUMO-HepI重组质粒的大肠杆菌，泳道3是转入突变质粒pESUMO-HepI169的大肠杆菌。图3为pESUMO-HepI169的突变位点测序结果。图4为利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测检测肝素酶的表达，泳道1是以导入空载质粒的大肠杆菌做阴性对照，泳道2是未经突变的HepI，泳道3是突变的Hep169。图5为HepI169的酶活检测。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。本专利技术提供一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。具体内容包括：(1)依照HepI的空间结构分析，改造获得一种比酶活较野生型提高48％的高活性肝素酶Hep169；(2)Hep169表达载体的构建：为实现高效可溶性基因工程表达，将Hep169与可促进二硫键形成、空间折叠的融合标签进行融合表达，这些融合标签包括SUMO、泛素、GST、Trx、DsbC、MBP等；为了确保融合标签不影响Hep169的空间结构及活性，在肝素酶I基因的N端引入柔性linker，可用的柔性linker包括(G4S)n(n＝1-4)、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG等；为了在后续纯化中切去融合标签，在融合标签与Hep169间引入了蛋白酶切割位点，可用的蛋白酶包括肠激酶、SUMO蛋白酶、凝血酶、TEV酶、Xa因子、3C蛋白酶等；(3)将重组质粒转化至基因工程宿主菌，所述宿主菌包括大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等。(4)重组表达产物Hep169的活性分析。结果显示：本专利技术所获得HepI突变体Hep169具有显著高于野生型HepI的酶活，所建立的基因工程表达体系可实现Hep169的高效可溶性表达。本专利技术方法不仅为HepI的生产提供了一种新发方法，而且所获得的高活性HepI-169可以更高效的用于低分子量肝素的工业化生产，这在医药工业方面具有广泛的应用前景。一、高活性HepI的重组工程菌构建方法(以SUMO融合的大肠杆菌表达体系为例)，步骤如下：1、构建N端引入G4S柔性linker-肠激酶切割位点(DDDDK)序列的HepI基因以下表中引物进行PCR扩增，以肝素黄杆菌基因组DNA为模板，用P3、P4引物通过PCR扩增后获得HepI基因序列，再以引物P1、P2(引入BsaI和BamHI酶切位点，下划线部分)再次扩增获得G4S柔性linker-肠激酶切割位点(DDDDK)-HepI，然后酶切、纯化、连接到pESUMO质粒中，得到pESUMO-HepI质粒。具体体系及扩增条件如下：扩增HepI的PCR反应体系反应条件：2、HepI169重组质粒的构建将pESUMO-HepI质粒转化大肠杆菌DH5α，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，培养12h后挑取单克隆，提取质粒进行PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高活性的肝素酶I(HepI)及其高效可溶性基因工程表达生产方法，其特征在于：依照肝素酶I的空间结构分析，改造获得一种比酶活较野生型提高48％的高活性肝素酶Hep169，然后利用分子生物学技术建立了Hep169的高效可溶性基因工程表达体系。

【技术特征摘要】
1.一种高活性的肝素酶I(HepI)及其高效可溶性基因工程表达生产方法，其特征在于：依照肝素酶I的空间结构分析，改造获得一种比酶活较野生型提高48％的高活性肝素酶Hep169，然后利用分子生物学技术建立了Hep169的高效可溶性基因工程表达体系。2.根据权利要求1所述高活性肝素酶I，其氨基酸序列如附录序列表所示。3.一种如权利要求1所述的Hep169高效可溶性基因工程表达体系，其特征在于：(1)针对宿主密码子偏爱性，对Hep169的编码基因进行优化，以大肠杆菌为例，其优化后的序列如附录序列表所示；(2)为实现高效可溶性基因工程表达，将Hep169与可促进二硫键形成、空间折叠的融合标签进行融合表达，...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗学刚，杨宝成，张同存，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12