一种羊依诺肝素钠及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉公开了一种羊依诺肝素钠及其制备方法与应用。羊依诺肝素钠由羊源的肝素制备而来，与USP 37和EP 8.0等药典规定的由猪肠粘膜肝素来源的依诺肝素钠，不仅是来源不同，而且在化学结构（二糖组成）和理化性质上有着一定的差异。羊依诺肝素钠通过制备工艺的优化和精制分级，可以符合除种源外的USP 37和EP 8.0依诺肝素钠质量放行标准，对比现版的USP 39和EP 8.6也是完全符合的。本发明专利技术还介绍了两种羊依诺肝素钠注射剂和制备方法，以及在动物体内抗凝试验的应用。羊依诺肝素钠的原料来源于羊，具有猪依诺肝素钠所不具有的清真性，羊依诺肝素钠及羊依诺肝素钠注射剂，可应用于抗凝、抗栓及清真药物中。

A breed of enoxaparin and preparation method and application thereof

The invention discloses a sheep enoxaparin sodium and preparation method and application thereof. Enoxaparin sodium heparin for sheep sheep source prepared, with USP 37 and EP 8 Pharmacopoeia by porcine mucosal heparin enoxaparin sodium source, not only from different sources, but also in the chemical structure (two sugar composition) and physicochemical properties have some differences. Optimization and purification of sheep by grading enoxaparin sodium preparation process, in addition to a source can meet the USP 37 and EP 8 ENOXAPRIAN quality release standard, compared with the current USP 39 and EP 8.6 is completely in line with the. The present invention also introduces two sheep enoxaparin sodium injection and preparation method, and application in animal in vivo anticoagulant test. Enoxaparin sodium raw materials from sheep sheep, pigs with halal ENOXAPRIAN do not have sheep and sheep, ENOXAPRIAN enoxaparin sodium injection, can be applied to anticoagulant and antithrombotic drugs and halal.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种羊来源的低分子肝素——羊依诺肝素钠，及其制备方法与应用，属于医药生物
，也属于清真药物。
技术介绍
依诺肝素钠(Enoxaparin Sodium，ES)是一种低分子的肝素钠盐，由大分子肝素经解聚而来，是目前临床上应用最广泛的抗凝抗栓药物之一。目前USP 39和EP 8.6规定依诺肝素钠的来源为猪肠粘膜肝素，而猪肝素不具有清真性。清真是穆斯林在中国流行的专用名称，穆斯林教义对食品和药品等有着明确的要求，哺乳动物中只允许食用牛、绵羊、山羊等反刍动物产品，禁食猪和狗等不反刍动物产品。全球穆斯林人口2013年突破16亿，占全球69亿人口的23％。在一些由穆斯林人口占多数的国家，如印度尼西亚、巴基斯坦、伊朗等等，清真市场缺失符合清真教义的抗凝药物，开发符合穆斯林教义的清真低分子肝素有着无可比拟的优势。本专利技术人在之前的专利申请(申请公布号：CN 105131153 A)中，详细描述了一种羊依诺肝素钠的制备方法，这种羊依诺肝素钠是本专利技术人首次报道的不同于猪来源依诺肝素钠的化合物，本专利技术将着重介绍此羊依诺肝素及其注射剂，包括其具体的理化性质和生物学性质研究。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种羊依诺肝素钠及其制备方法与应用。本专利技术的目的，将通过以下技术方案得以实现：羊依诺肝素钠，是以羊源的肝素制备得到的。所述羊依诺肝素钠的二糖组成，以肝素酶酶解后的SAX-HPLC分析，主要二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量在60％-74％之间，含量次多的二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)和ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)分别是8％-11％和4％-7％，与抗-Ⅹa和抗-Ⅱa活性至关重要的核心五糖中3-位硫酸化的四糖峰——ΔⅡA-ⅡSglu，含量是1.2％-2.1％；而在猪肠粘膜依诺肝素钠中，ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS的含量分别是58％-66％、9.5％-11.5％和5.8％-7.8％，ΔⅡA-ⅡSglu的含量则是2.1％-2.5％。所述羊依诺肝素钠包括绵羊来源的依诺肝素钠和山羊来源的依诺肝素钠。所述绵羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为66％-74％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为8％-10％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为4％-6％；所述山羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为60％-68％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为9％-11％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为5％-7％。进一步地，绵羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为66.26％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为9.15％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为6.44％；山羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为63.58％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为10.71％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为10.27％。所述羊依诺肝素钠的化学结构，以核磁共振氢谱和核磁共振碳谱来判断，羊依诺肝素钠与猪依诺肝素钠的谱图大致相同，但氢谱δ2.04ppm和碳谱δ24.9ppm共同反映的氮-乙酰基的甲基峰，羊依诺肝素钠中积分要小一些，反映出糖链上氮-乙酰基修饰更少。所述的核磁共振方法，更优的方案是采用异核单量子关系-核磁共振(HSQC-NMR)等更高级的二维核磁分析，以此可以明确判断一些具体糖链结构上的差异。所述羊依诺肝素钠的磺酸根羧酸根比例分析，方法遵照USP 37进行，磺酸根羧酸根比例反映糖链上的磺酸根修饰情况，羊依诺肝素钠的磺酸根羧酸根比例在2.0以上，USP 37和EP 8.0规定的猪肠粘膜依诺肝素钠的放行标准中，该项指标是不小于1.8，羊依诺肝素钠的磺酸根羧酸根比例稍高，反映出羊依诺肝素钠的磺酸化修饰程度更高。所述羊依诺肝素钠的生物学抗凝活性，参照USP 37进行分析，抗-Ⅹa活性折干后在90-125单位每毫克之间，抗-Ⅱa活性折干后在20-35单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在2.8-4.8之间。其中抗-Ⅹa活性和抗-Ⅱa活性都与USP 37和EP 8.0规定的依诺肝素钠放行标准一致，但抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例要稍小一些，在USP 37和EP 8.0中，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在3.3-5.3之间。优选地，所述羊依诺肝素钠可进行精制和分级，使抗-Ⅹa活性和抗-Ⅱa活性及两者之间的比例，符合USP 37对依诺肝素钠的放行标准。所述羊依诺肝素钠的分子量及分子量分布，参照USP 37进行分析，羊依诺肝素钠的重均分子量在3800-5000之间，其中分子量<2000部分的比例在12.0％-20.0％之间，2000<分子量<8000部分的比例在68.0％-82.0％之间，分子量>8000部分的比例不超过18.0％。羊依诺肝素钠的分子量及分子量分布，符合USP 39和EP 8.6规定的依诺肝素钠放行标准要求。所述羊依诺肝素钠的1,6-酐含量测定，具体是利用肝素酶酶解后进行强阴离子交换树脂-高效液相色谱(SAX-HPLC)分析检测，酶解和检测方法遵照USP32附录<207>“依诺肝素钠的1,6-酐衍生物检查”进行。所述羊依诺肝素钠的1,6-酐含量在15％-25％之间，符合USP 37和EP 8.0规定的依诺肝素钠放行标准要求。优选地，所述羊依诺肝素钠可进行精制或分级。羊依诺肝素钠的精制包括脱色、反复的盐水复溶醇沉等方式，分级则包括阴离子交换分级或超滤分级，以使羊依诺肝素钠产品的指标符合USP 37和EP 8.0规定的除种源外依诺肝素钠放行标准要求，包括提高抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例以及其他指标，对比现行的药典版本USP 39和EP 8.6也是完全符合的。优选地，所述羊依诺肝素钠在防治与抗凝、抗栓有关疾病中的应用，以及开发为清真抗凝抗栓药物。以上所述羊依诺肝素钠的制备方法，与本专利技术人在之前的专利申请(申请公布号：CN 105131153 A)主张的制备方法相同，具体采用如下步骤：S1、原料羊肝素的预处理：将羊肝素钠粗品溶解后进行溶液脱色，精过滤，再在室温下进行醇沉精制，收集沉淀物，干燥获得羊肝素；S2、羊肝素季铵盐的制备：将S1中获得的羊肝素溶解配制成羊肝素水溶液，并与苄索氯铵水溶液进行混合，过滤或离心获得羊肝素季铵盐，并进行洗涤干燥，制得羊肝素季铵盐；S3、羊肝素苄酯的制备：将S2中干燥得到的羊肝素季铵盐与有机溶剂二氯甲烷及氯化苄按重量比例混合酯化，在酯化后的羊肝素季铵盐中滴加醋酸钠甲醇溶液，制得羊肝素苄基酯沉淀，将羊肝素苄基酯沉淀进行过滤、洗涤、干燥，制得羊肝素苄基酯；S4、羊依诺肝素钠成品制得：将S3中的羊肝素苄基酯进行碱解聚，脱色，以酸中和至中性，醇沉淀，精制，干燥，得到羊依诺肝素钠成品。优选地，S1中采用质量浓度为1％-3％的氯化钠水溶液溶解羊肝素钠粗品进行脱色、过滤和精制，直至预处理后羊肝素钠的水溶液澄清且色度不深于5号标准色；醇沉精制的沉淀剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种或几种的组合。S2中苄索氯铵与羊肝素钠的重量比为2-5:1。S3中酯化温度30-40℃，羊肝素季铵盐、二氯甲烷、氯化苄的质量比为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羊依诺肝素钠，其特征在于，以羊源的肝素制备。

【技术特征摘要】
2015.08.21 CN 20151051934901.一种羊依诺肝素钠，其特征在于，以羊源的肝素制备。2.根据权利要求1所述的羊依诺肝素钠，其特征在于，羊依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为60％-74％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为8％-11％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为4％-7％；与抗-Ⅹa和抗-Ⅱa活性至关重要的核心五糖中3-位硫酸化的四糖峰：ΔⅡA-ⅡSglu，含量为1.2％-2.1％。3.根据权利要求1所述的羊依诺肝素钠，其特征在于，羊依诺肝素钠的核磁共振氢谱δ2.04ppm和核磁共振碳谱δ24.9ppm共同反映的氮-乙酰基的甲基峰的积分小于猪来源的依诺肝素钠相应甲基峰的积分。4.根据权利要求1所述的羊依诺肝素钠，其特征在于，羊依诺肝素钠的磺酸根和羧酸根比例为2.0以上。5.根据权利要求1所述的羊依诺肝素钠，其特征在于，羊依诺肝素钠的抗-Ⅹa活性折干后在90-125单位每毫克之间，抗-Ⅱa活性折干后在20-35单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在3.3-5.3之间。6.根据权利要求1所述的羊依诺肝素钠，其特征在于，所述羊依诺肝素钠，重均分子量在3800-5000之间，其中分子量<2000部分的比例在12.0％-20.0％之间，2000<分子量<8000部分的比例在68.0％-82.0％之间，分子量>8000部分的比例不超过18.0％；所述1,6-酐含量在15％-25％之间。7.根据权利要求2所述的羊依诺肝素钠，其特征在于，所述羊依诺肝素钠包括绵羊来源的依诺肝素钠和山羊来源的依诺肝素钠，其中绵羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为66％-74％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为8％-10％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为4％-6％；山羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为60％-68％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为9％-11％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为5％-7％。8.根据权利要求7所述的羊依诺肝素钠，其特征在于，所述羊依诺肝素钠包括绵羊来源的依诺肝素钠和山羊来源的依诺肝素钠，其中绵羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为66.26％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为9.15％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为6.44％；山羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为63.58％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为10.71％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为10.27％。9.权利要求1-8任一项所述的羊依诺肝素钠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：...

【专利技术属性】
技术研发人员：金永生，靳彩娟，王宁霞，姚亦明，
申请(专利权)人：苏州融析生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32