一种单链核酸药物分子量的分析方法技术

本发明专利技术公开了一种单链核酸药物分子量的分析方法，包括S1、单链核酸对照品溶液的配制；S2、单链核酸供试品溶液的配制；S3、仪器分析；S4、结果计算。本发明专利技术的分析方法，将液相色谱法和GPC软件分析相结合，利用多个已知分子量的单链核酸对照品，在GPC软件中以单链核酸对照品在色谱柱中的相对保留时间和对应的分子量建立标准曲线，随后在GPC软件中导入供试品溶液经色谱分析后得到的的色谱信号，计算得出供试品的重均分子量及分子量分布，该方法准确、高效和可靠，适用于单链核酸药物的分子量及分布分析，填补了单链核酸药物分子量分析领域的空白。空白。空白。

【技术实现步骤摘要】
一种单链核酸药物分子量的分析方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种单链核酸药物分子量的分析方法。

技术介绍

[0002]核酸药物包括从某些动物、微生物的细胞内提取出的核酸，以及通过人工合成法制备的具备核酸结构且具有一定药理作用的物质。单链核酸药物是核酸药物中特殊的一类，现有的临床药物种类较少。
[0003]去纤苷，中文全名为去纤维蛋白多核苷酸，是从猪的肠粘膜中提取的一种多聚脱氧核糖核酸钠盐，属于单链核酸药物。去纤苷具有促纤溶作用，临床用于治疗严重肝静脉阻塞疾病，以及接受血液或骨髓造血干细胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation，HSCT)后出现的肝静脉阻塞(Veno
‑
occlusive Disease，VOD)并伴有肾或肺功能异常的成人或儿童患者。目前，去纤苷是唯一被批准用于VOD治疗的药物，属于救命必需的“孤儿药”。化学性质方面，去纤苷为DNA聚合物，大部分由单链DNA组成，重均分子量为13KDa
‑
20 KDa，其中磷酸占9.0％，胸腺嘧啶占10.5％，胞嘧啶占6.4％，腺嘌呤和鸟嘌呤分别占9.0％和7.7％，呈钠盐形式。
[0004]目前，天然的DNA主要由双链DNA组成，而对双链DNA的分子量检测主要采用电泳法、质谱法和色谱法，其中电泳法简单便捷，但是分辨率和准确度差；质谱法相对复杂，解析困难；而色谱法相对准确。但是，类似于去纤苷这种单链核酸药物，它们属于混合物，由分子量大大小小不一的单链及部分双链DNA混合组成，现有技术中缺乏能够准确反映这种单链核酸药物特性的分子量分析方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种能够高效准确的反映单链核酸药物分子量及其分布的分析方法。
[0006]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0007]一种单链核酸药物分子量的分析方法，包括以下步骤：
[0008]S1、对照品溶液的配制：称取单链核酸对照品，将所述单链核酸对照品以流动相配制成多份已知分子量的对照品溶液；
[0009]S2、供试品溶液的配制：称取单链核酸药物的供试品，将所述供试品以流动相配制成供试品溶液，将所述供试品溶液沸水浴加热，随后置于冰水浴中冷却；
[0010]S3、仪器分析：采用相同的液相色谱仪和流动相，分别对对照品溶液和供试品溶液进行色谱分析；
[0011]其中，所述液相色谱仪的色谱条件包括：
[0012]色谱柱：分子尺寸排阻色谱柱；检测器：紫外检测器或DAD检测器；
[0013]S4、结果计算：分别将多份对照品溶液在所述液相色谱仪中的相对保留时间以及对应的已知分子量导入GPC软件中，建立标准曲线，随后将供试品溶液经色谱分析后得到的
色谱信号导入GPC软件中，在GPC软件中计算出所述供试品的重均分子量及分子量分布。
[0014]优选地，所述单链核酸对照品包括多个以AC为单元的重复序列，以(AC)
n
表示。在DNA链中，A为腺苷酸，C为胞苷酸，连续的AC序列不会形成DNA链内或链间的配对，只能为单链DNA。天然DNA的另外两种核苷酸，T为胸腺苷酸，G为鸟苷酸，相对情况下，A、C比T和G更为易得和合成简便。此外，AC组合的核苷酸单元的分子量约为330Da，可以最大限度地与天然DNA的平均单元分子量接近，因此，这种AC组合优于单纯的聚A(A
n
)或者聚C(C
n
)或者聚TG【(TG)
n
】等序列。据此，本专利技术专利优选使用(AC)
n
作为单链核酸对照品。而据本专利技术技术范例变换或引申，使用其他序列变换方式作为单链核酸对照品的，也应视为在本专利技术的技术范围之内。
[0015]进一步优选地，所述单链核酸对照品选自(AC)5、(AC)
25
和(AC)
45
。
[0016]更进一步优选地，所述单链核酸对照品包括(AC)5、(AC)
25
和(AC)
45
中的多种或三者的混合物。所述(AC)5的分子量为3148Da，所述(AC)
25
的分子量为16075Da，所述(AC)
45
的分子量为29003Da。基于当前单链核酸药物的种类少，以去纤苷药物研究为重要对象，其重均分子量在13KDa
–
20KDa之间，考虑到分子量的分布范围，本专利技术选择了涵盖范围最适宜的(AC)5、(AC)
25
和(AC)
45
作为单链核酸对照品，而据本专利技术技术范例变换或引申，使用其他分子量的单链核酸对照品的，也应视为在本专利技术的技术范围之内。
[0017]优选地，在步骤S1中，所述对照品溶液的配制浓度为0.2
‑
0.5mg/mL。
[0018]优选地，在步骤S2中，所述供试品溶液的配制浓度为0.2
‑
0.5mg/mL。
[0019]优选地，在步骤S2中，沸水浴加热的时间为8
‑
15min，冰水浴冷却的时间为1
‑
4min。基于本专利技术研究对象为单链核酸药物，将供试品溶液经过沸水浴加热后再进行冰水浴冷却，可以有效的打开分子链间或链内的错误配对结合，更为充分地保证供试品的单链形态。
[0020]优选地，在步骤S1、S2和S3中，所述的流动相为包含乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲溶液和/或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液。这些溶液，一是在紫外区没有吸收特性，不会干扰目标物核酸的紫外检测；二是EDTA可以螯合金属离子，保证供试品及单链核酸对照品所结合的阳离子形态为均一态；三是可以提供弱碱性的pH范围，可以大限度地兼顾色谱柱的耐受条件与保证供试品及单链核酸对照品的单链DNA钠盐形态。
[0021]进一步优选地，在步骤S1、S2和S3中，所述流动相的pH为7.0
‑
9.0，所述的流动相为加有乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲溶液或加有乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，其中乙二胺四乙酸的浓度为0.1
‑
5mM。
[0022]更进一步优选地，所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸钠盐缓冲液，其浓度为10
‑
200mM；所述三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷
‑
盐酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷
‑
磷酸盐缓冲液，其浓度为10
‑
200mM。
[0023]优选地，在步骤S3中，所述液相色谱仪的色谱条件还包括：柱室温度：10
‑
30℃；流速：0.4
‑
0.8mL/min；进样量：5
‑
25μL。
[0024]优选地，在步骤S3中，所述色谱柱采用500A孔径的分子筛柱，填充剂为亲水改性键合硅胶，该填充剂适合分离分子量为15000Da
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单链核酸药物分子量的分析方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、对照品溶液的配制：称取单链核酸对照品，将所述单链核酸对照品以流动相配制成多份已知分子量的对照品溶液；S2、供试品溶液的配制：称取单链核酸药物的供试品，将所述供试品以流动相配制成供试品溶液，将所述供试品溶液沸水浴加热，随后置于冰水浴中冷却；S3、仪器分析：采用相同的液相色谱仪和流动相，分别对对照品溶液和供试品溶液进行色谱分析；其中，所述液相色谱仪的色谱条件包括：色谱柱：分子尺寸排阻色谱柱；检测器：紫外检测器或DAD检测器；S4、结果计算：分别将多份对照品溶液在所述液相色谱仪中的相对保留时间以及对应的已知分子量导入GPC软件中，建立标准曲线，随后将供试品溶液经色谱分析后得到的色谱信号导入GPC软件中，在GPC软件中计算出所述供试品的重均分子量及分子量分布。2.根据权利要求1所述的一种单链核酸药物分子量的分析方法，其特征在于：在步骤S1中，所述单链核酸对照品包括多个以AC为单元的重复序列，以(AC)
n
表示。3.根据权利要求2所述的一种单链核酸药物分子量的分析方法，其特征在于：所述单链核酸对照品选自(AC)5、(AC)
25
和(AC)
45
。4.根据权利要求3所述的一种单链核酸药物分子量的分析方法，其特征在于：所述单链核酸对照品包括(AC)5、(AC)
25
和(AC)
45
中的多种或三者的混合物。5.根据权利要求1所述的一种单链核酸药物分子量的分析方法，其特征在于：在步骤S1中，所述对照品溶液的配制浓度为0.2
‑
0.5mg/mL。6.根据权利要求1所述的一种单链核酸药物分子量的分析方法，其特征在于：在步骤S2中，所述供试品溶液的配制浓度为0.2
‑
0.5mg/mL。7.根据权利要求1所述的一种单链核酸药物分子量的分析方法，其特征在于：在步骤S2中，沸水浴加热的时间为8
‑
15min，冰水浴冷却的时间为1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚瑶，金永生，尹洪洋，靳彩娟，任鑫，陆晓华，周华，肖洋，朱祥平，姚亦明，
申请(专利权)人：苏州融析生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：